2022 Fiscal Year Research-status Report

Analysis of mammalian survival mechanism under stressed temperature using novel mutant-HSF1 knock-in mice

Research Project

Project/Area Number	22K06044
Research Institution	Yamaguchi University
Principal Investigator	林田直樹山口大学, 大学院医学系研究科, 講師 (40420517)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	角田茂東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (80345032)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	熱ショック転写因子 / 温熱ストレス / 変異型マウス / 系統化成功 / ゲノム編集 / HSF1 / 熱耐性
Outline of Annual Research Achievements	2022年度は、本研究課題の中心となる、新規の変異型熱ショック転写因子1（HSF1）のノックインマウスの作製に1年間を費やした。具体的に作製を開始したのは、熱耐性が強くなることが予想される活性型 HSF1 ノックインマウス (caHSF1-KI) と、熱耐性が弱くなると考えられる DNA 結合能欠損 HSF1 ノックインマウス (R71G-KI) の2種類である。いずれも、ゲノム編集の手法を用いて行った。 caHSF1-KI については、活性型にするために除去しようとした配列が若干異なってしまったものの、1匹変異を有するマウスを得ることが出来た。除去を狙った配列はΔ221-315であったが、この1匹は5アミノ酸が残ってしまうΔ226-315の変異を有するマウスであったものの、この5アミノ酸が残っていても活性型になると予想し、このマウスの系統化を目指して交配を行ったところ、この変異を受け継ぐ次世代のマウスを得ることに成功した。この変異マウスが多数得られたため、全臓器の採取を数匹から行い、これからタンパク質およびRNAを回収して、HSF1の主なターゲット分子であるHSP70や同じHSFであるHSF2の発現の解析を行うと共に、目的である caHSF1-KI を得るため、得られたマウスを用いて、L395E変異を入れるゲノム編集を行っている。 R71G-KI についても、ゲノム編集を行った産仔が得られており、現在、正しい変異が入っているかを確認中である。決して早くマウス作製が進んでいるとは言えないが、着実に進んでいるのは間違いなく、想定の範囲内で順調な結果が得られたと考えている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 2022年度の目標は、ゲノム編集を用いた新規変異型HSF1ノックインマウスの作製であったが、途中上手く行かない段階があったものの、これらはこの種類の実験では必ずと言って良いほど起こる類いのものであり、全体として、想定外のことは起こらず、順調に実験（マウス作製）が進んでおり、安心している。
Strategy for Future Research Activity	目的の2種類のマウスの完成が、2023年度の目標である。今年度前半にも2種類出来る可能性があるので、実際に完成した場合には、全臓器を回収してHSP70、HSF2等の発現確認を行いつつ、caHSF1-KI と R71G-KI を3匹ずつ用いて、まず37度でどれだけ生存するかのプレ実験を行いたい。一方で、現在作製が進んでいるマウスの背景はICRなので、世界でもっと使われているC57BL/6へのバッククロスを行い、背景の異なるこれらの変異型マウスを作製し、同様の実験を行いたい。37度以外では42度や35度などの温度の実験を考えており、2種類のマウスに加え野生型マウスも入れて、温熱ストレス下での生存データを得られた時点で、論文の作成と、特許申請の準備に入ろうと考えている。
Causes of Carryover	マウスの作製が早く進んだ場合のことを考え、初年度の使用額はどれだけ実験が順調に進んでも十分金額的に次の実験が可能となる金額を見込んで記載した。実際には、実験は順調に進んだが、通常のスピードで進んだために、次年度使用額が生じてしまった。この額は、2023年度に、予定通り当初の計画にあった実験に充てる予定である。