2022 Fiscal Year Research-status Report
がん細胞の細胞死が腫瘍微小環境の構築に与える影響の解明
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22K06048
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
中西 祐輔 日本大学, 生物資源科学部, 講師 (20579411)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 腫瘍免疫 / 微小環境 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞死は個体の成長と発展及び組織の恒常性維持にとって必須の生命現象の1つである。一方、腫瘍組織内は、低酸素などの環境的要因により、一定の頻度でネクローシスと呼ばれる細胞死が起きていることが知られている。しかし、腫瘍組織内におけるがん細胞の内因性細胞死の有無および生理的意義については明らかになっていない。
申請者の予備検討から、マウス乳がん細胞株4T1で誘導した腫瘍は、大腸がん細胞株CT-26で誘導した腫瘍と比較して、アポトーシスを表す活性化カスペース3の発現やTUNEL陽性の細胞の頻度が高いこと、および好中球が多量に浸潤して、NETsと呼ばれる腫瘍促進と予想される応答を起こしていることを見出している。これらの結果から、一部のがん細胞は増殖しながらアポトーシスを起こし、腫瘍の成長に有利な微小環境を構築していることが示唆された。
がん細胞がどのようにして、細胞死を有利な微小環境作りに利用しているかを検討するため、正常細胞がアポトーシスを起こした際に、免疫応答を惹起しないようにするために利用している非選択的チャネルであるパネキシン1（Panx1）に注目した。Panx1を介した代謝産物がNETsを誘導するという仮説の検証のため、ゲノム編集技術を用いてPanx1欠損4T1細胞株を樹立した。作製したPanx1欠損4T1細胞株はin vitroにおいて、野生型と同程度の増殖能を有することおよびアポトーシスの頻度を示すことを確認した。
次に、Panx1欠損細胞株をマウスに皮下移植したところ、野生型と同程度の好中球の浸潤が認められるにも関わらず、腫瘍サイズおよび重量の減少が認められた。一方、浸潤している好中球にNETsの応答は見られなかったことから、Panx1を介した代謝産物がNETsの誘導に寄与している可能性が強く示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
がん細胞がアポトーシスを起こすことにより、代謝産物を産生して腫瘍の成長に有利な微小環境を構築するという仮説の検証のため、ゲノム編集技術を用いてPanx1を欠損させた4T1細胞株を樹立した。ガイドRNAの設計、プラスミドの構築、シングルコロニーからの回収などに多少の時間を有したものの、シーケンスによる遺伝子配列の検定から、Panx1のエクソン1に一塩基欠損した細胞株を得ることができた。Panx1のタンパク発現の解析は、検出法にまだ問題を抱えており今後の課題であるが、おおむね順調に進展していると判断できる。
また、好中球が放出するNETsが腫瘍に与える影響を解析するため、NETsの誘導に必須のヒストンシトルリン化酵素PAD4の遺伝子欠損マウス（Padi4欠損マウス）を用いて解析することも併せて進行しているが、BALB/cマウス由来の4T1細胞株を移植できるために、遺伝的背景の変更が必要であったが、そのバッククロスも順調に行うことができ、BALB/cマウスの遺伝的背景を持つPadi4欠損マウスを得ることにも成功した。
Padi4欠損マウスに4T1細胞を皮下移植すると、腫瘍サイズの縮小傾向が見られたことから、NETsは抗腫瘍免疫に作用していると考えられた。
以上のことから、Panx1を介したNETsの制御が、腫瘍形成に与える影響を解析する土台ができたと判断することが可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
4T1細胞がアポトーシスを起こした際に、Panx1を介して放出する代謝産物はポリアミンの1種であるスペルミジンだと予想していた。これは、申請時の予備検討から、試薬グレードのスペルミジンで骨髄由来好中球を刺激するとNETsが誘導できるという結果を得ていたからである。一方、Panx1欠損細胞株のin vitroでの培養上清中に含まれるスペルミジン量をELISA法にて定量すると野生型の培養上清と比較して半分程度しか産生量が低下していなかった。
記述の様に、Panx1を欠損させた細胞株で誘導した腫瘍の組織染色ではNETsが観察されなかったことから、スペルミジン以外の代謝産物もNETsの誘導に関与している可能性があり、今後、それらの因子を同定していきたいと考えている。
また、4T1細胞はPD-1やCTLA-4といったチェックポイント阻害剤不応答性の細胞株であることが知られている。今後はPanx1欠損細胞株を移植したマウスにチェックポイント阻害剤を投与することにより、代謝産物の放出を介したNETsの制御と免疫療法の併用が可能かについても併せて検討を進めていく。
以上の検討から、がんの新たな免疫逃避機構の解明を進めるとともに、その制御の有効性について検証することにより、がん免疫療法の発展に寄与していきたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
がん細胞がアポトーシスを介して産生する代謝産物が、NETsの誘導因子である仮説の検証を進めていく予定であるが、当初、予想していた代謝産物の1つだけではなく複数の代謝産物がNETsの誘導に関与している可能性が示唆されている。代謝産物のELISAキットは、取り扱いメーカーが少なく、海外製であることが多いため高額になるケースが多い。よって、本年度助成金と合せて購入する必要があり、その費用を次年度に繰り越し、本年度助成金と合せて執行する予定である。
また、申請計画がおおむね順調に進行していることから、Panx1欠損細胞株と免疫チェックポイント阻害剤との併用実験も検討している。これらのin vivoで使用する抗体の購入とその実験の遂行に必要なマウスの購入が必要なため次年度使用額が発生した。
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