2022 Fiscal Year Research-status Report

光操作を用いた不整脈モデル動物の創出による心臓拍動制御メカニズムの解明

Research Project

Project/Area Number	22K06072
Research Institution	National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
Principal Investigator	森川久未国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究員 (90707217)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	海老原達彦国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究グループ付 (00344119) 白吉安昭鳥取大学, 医学部, 准教授 (90249946)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	光遺伝学 / 光操作型Cre組換え酵素 / iPS細胞 / マウスモデル / 不整脈 / 疾患モデル
Outline of Annual Research Achievements	本研究では心臓の不整脈の一種である徐脈性不整脈を、光遺伝学技術を用いて再現することを目的にしている。このための技術開発として、2022年度は、(1) マウスモデルを用いた光操作技術の確立と、(2) ヒトiPS細胞におけるPA-Cre恒常発現細胞株の樹立および光照射によるCre-loxP組換えの確認について研究を進めてきた。 (1) については、マウス初期胚において光照射によるCre-loxP組換え手法の確立を行った。特にマウス系統の最適化と、光照射のタイミングを検討した結果、初期胚における青色光照射特異的Cre-loxP組換えの条件を確立できた。 (2) については、PA-Creを恒常発現するpiggyBACベクターをhiPS細胞（409B2株）へ遺伝子導入し、細胞株を樹立した。青色光照射によるスクリーニングにより、青色光照射時の組換え効率が最も高く、暗所時での自発的組換え（dark leak）が低い細胞株を選別した。このPA-Cre恒常発現iPS細胞株を心筋細胞へ分化誘導した結果、拍動する心筋細胞を得ることができた。さらに分化誘導した心筋細胞に、青色光照射を行うと、照射部位に限定してCre-loxP組換えとレポーターの赤色蛍光タンパク質の発現を確認することができた。加えて、分化誘導途中で青色光照射を行った際にも、照射細胞を赤色蛍光レポーターの発現で追跡できることが分かった。以上より、PA-Creを恒常発現するヒトiPS細胞株の樹立に成功し、光照射細胞を永続的に追跡できる実験系を確立した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 2022年度は当初の予定通り、(1)マウスモデルでの光操作技術の確立、(2) PA-Cre恒常発現iPS細胞株の樹立を行った。結果、当初の計画通りに、研究は極めて順調に進んでいる。この理由として、2022年度は(1)の光照射条件の確立に成功し、マウス初期胚での青色光照射によるCre-loxP組換えおよび細胞系譜追跡と遺伝子ノックアウトの実験条件を確立できたことと、この結果をまとめて論文投稿を行ったことが成果として挙げられる。2023年度はこの論文のrevision等に対応し、2023年度中に論文発表する計画である。さらに、(2) のヒトiPS細胞でも、PA-Cre恒常発現iPS細胞株の樹立と、機能検証が順調に進んだ。樹立した細胞株は当初設計した通りに、任意の時期でPA-Creを発現させることができ、青色光照射によってCre-loxP組換えを引き起こすことが可能であった。さらに、組換え後にレポーターとして赤色蛍光タンパク質を発現することができた。また、piggyBACトランスポゾンのシステムを利用することにより、高効率で目的の細胞を得ることができ、スクリーニングも迅速に進めることができている。樹立した細胞株については、性状解析を進めて、現在論文投稿準備を進めている段階である。今後の実験に不可欠なiPS細胞株を順調に樹立できたため、当初の予定通りに研究が進んでいると結論している。
Strategy for Future Research Activity	2022年度の進捗を受け、2023年度は以下の3点について重点的に研究を進めていく。 (1) 拍動制御遺伝子コンディショナルノックアウトiPS細胞株（flox細胞株）の樹立：今年度に樹立したPA-Cre恒常発現iPS細胞において、拍動制御遺伝子をPA-Creによりコンディショナルにノックアウトできる、二重遺伝子改変iPS細胞株を樹立する。ゲノム編集技術を使用することにより、拍動制御遺伝子にloxP配列をノックインしたiPS細胞株を高効率に樹立する。細胞株の樹立の一部は、分担者の白吉博士が担う。 (2)PA-Cre恒常発現iPS細胞における光照射条件の最適化： 2022年度に樹立したPA-Cre恒常発現iPS細胞を用いて、青色光照射時間と照射強度の比較を行い、高効率にCre-loxP組換えを引き起こすことができ、かつ光毒性が低減している照射条件を見出す。さらに、共焦点顕微鏡などの光照射デバイスを使用し、時空間を厳密に限定した光照射の手法や条件を確立する。 (3) 光照射による遺伝子ノックアウト手法の確立： (1)で樹立したflox細胞株において、(2)で最適化した青色光照射条件を用い、光照射と照射時の遺伝子ノックアウトを確認する。照射細胞における組換えレポーターの赤色蛍光の発現と、genotyping PCRにより、ノックアウトの確認を行う計画である。この遺伝子ノックアウトが順調に進めば、flox細胞株を心筋分化誘導し、分化心筋細胞での青色光照射と照射時の表現型について解析を進めていく。
Causes of Carryover	本年度は、マウスの実験費用や飼育費を節約できたことや、iPS細胞株の樹立が非常に順調に進んだため、培養経費や消耗品費を節約することができた。このため本年度の余剰金は、次年度の活動経費へ引き継ぐこととした。次年度は、マウス実験に活動経費を重点的に使用するとともに、今年度得たヒトiPS細胞での研究成果を発表するために、学会発表や論文発表費用として、研究費を使用する計画である。