2022 Fiscal Year Research-status Report
酵母におけるニトロ化タンパク質還元酵素の同定と機能解析
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22K06084
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
那須野 亮 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (90708116)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 一酸化窒素 / 還元酵素 / ニトロレダクターゼ / 酵母 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
遊離ニトロチロシン（NT）を、ニトロ化タンパク質還元酵素（NPR）のモデル基質と考え、酵母の遊離NT還元活性の検出を試みた。酵母粗酵素液と遊離NTを、種々の補酵素・補因子存在下で反応させ、LC/MS/MSによりアミノチロシン（AT）の生成を評価したところ、NADPHなどの電子供与体存在下で非酵素的に微量のATが生成したものの、酵素反応依存的なAT量増加は検出されなかった。
続いて、酵母ニトロレダクターゼ（NTred）であるHbn1を、大腸菌を用いた組換え酵素として精製し、酵素活性を測定したところ、既知の酵母NTredであるFrm2と同様に、芳香族ニトロ化合物である4-nitroquinoline N-oxide（4NQO）に対して還元活性を示した。また、Hbn1は、4-nitropyridine N-oxide（4NPO）にも還元活性を示したことから、芳香族ニトロ化合物に対するNTredによる還元反応には、quinoline骨格ではなくpyridine骨格が必須であることが示唆された。
一方、酵母NTred遺伝子（FRM2, HBN1）を欠損させた酵母変異株の表現型を解析したところ、毒性量のNOに感受性を示した。このことから、酵母NTredは酵母のNO耐性に重要であることが示された。
さらに、精製Hbn1とNOドナー、蛍光NOプローブを反応させて、蛍光強度の経時変化を評価することにより、Hbn1によるNO濃度分解活性を解析したところ、Hbn1によりNOが分解されることが示唆された。また、系内の酸素濃度を増加させるとHbn1によるNO分解活性が低下することが示された。以上のことから、酵母NTredがNOを直接還元的に分解することで、酵母のNO耐性に寄与するという新たな機構が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の目的であったNPR活性の検出やNPR分子の同定には至っていないものの、酵母NTredがNOを還元的に分解してNO耐性に寄与するという新たなNO耐性機構を示唆する結果を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の計画としては、酵母NTredによるNO分解・NO耐性機構の詳細解明を早急に行う。具体的には、NTredによるNO分解（還元）の反応生成物同定、補因子や補酵素の要求性などの酵素特性の解析、速度論的解析、酸素による酵素反応阻害の解析を行う。また、酵母細胞内のNO濃度がNTredにより変化するかも評価する。
一方、NPRの同定に関しては、NPRの基質タンパク質を同定した後、NPR活性評価を行う方針で研究を進める。NO処理した酵母をプロテオーム解析に供し、NPRの基質タンパク質を同定し、これを用いたNPR活性評価系を構築することで、NPR分子の同定を効率的に行う。
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| Causes of Carryover |
22年度の早い段階において、酵母NTredによるNO還元酵素活性の可能性を見出したことから、その解析に注力したため、NPR同定のためのプロテオーム解析を用いたスクリーニング等は実施しなかった。これらの計画は、23年度以降に実施する予定である。
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