2022 Fiscal Year Research-status Report
クライオ電子顕微鏡によるネイティブなセントロメアクロマチンの立体構造解析
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22K06098
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
滝沢 由政 東京大学, 定量生命科学研究所, 准教授 (00434291)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | クロマチン / ヌクレオソーム / セントロメア / クライオ電子顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
真核生物のゲノムDNAは、クロマチン構造を形成することにより、核内に収納されている。クロマチンの中でもセントロメア領域は、分裂期の染色体に現れるくびれた部位で、キネトコア複合体と呼ばれるタンパク質群が集積する。そこへ微小管が結合するとことで、染色体の娘細胞への均等分配が起こる。セントロメアの機能が不完全であると、染色体の不安定化や不均等分配を引き起こすことが知られている。しかし、細胞内のセントロメアクロマチンの立体構造は明らかとなっておらず、特にキネトコア複合体の集積に重要と考えられる高次セントロメアクロマチン構造は未知のままである。本研究は、真核生物の染色体分配に必要不可欠なクロマチン領域であるセントロメアクロマチンの役割を明らかにすることを目的としている。ヒト細胞より精製したネイティブなセントロメアクロマチンの立体構造をクライオ電顕単粒子解析およびクライオ電子線トモグラフィーによるクロマチン構造解析を行うことで目的を達成する。2022年度は、クライオ電顕構造解析に適したネイティブなクロマチンの調製方法を検討した。クロマチンの抽出方法、クロマチンの断片化処理方法、クロマチン構造を安定化させるための化学固定の方法を検討した。調製したクロマチンは、急速凍結しクライオ電顕による観察を行うことでクロマチンの構造状態を確認した。検討の結果、高次構造を保った状態と考えられるクロマチンのクライオ電顕観察に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
2022年度は、クライオ電顕構造解析に適したネイティブなクロマチンをHeLa細胞より抽出する方法を検討した。細胞核からのクロマチン抽出方法、可溶化のためのクロマチンの断片化処理方法、クライオ電顕構造解析のためのクロマチン構造を安定化させる化学固定法を検討した。調製したクロマチンは、クライオ電顕用グリッド上で急速凍結しクライオ電顕による観察を行った。これらの検討により、予想していた以上に高次構造が保持されたクロマチン構造をクライオ電顕により観察することに成功した。クライオ電顕により観察されたクロマチンは、クロマチンの基本単位であるヌクレオソームの配向が分かり、ヌクレオソーム間のリンカーDNAも認識できた。以上より、本研究は当初の計画以上に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
2022年度にクロマチンの今後は、ネイティブなクロマチンのクライオEM構造解析のワークフローを確立するため、細胞核内に最も豊富に存在するヒストンH3.1を含む通常型ヌクレオソームの解析を中心に進める。ヒストンH3.1を特異的に認識する抗体を用いて、クロマチン断片の免疫沈降を行う。得られたクロマチンは、凍結条件を検討し、クライオ電子顕微鏡により観察を行う。良質のグリッドが得られ次第、単粒子解析およびクライオ電子線トモグラフィーによる立体構造解析を試みる。通常型のヌクレオソームで確立したワークフローを応用することで、細胞よりCENP-Aヌクレオソームを精製することができる。
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