2022 Fiscal Year Research-status Report
非硫酸化型HNK-1糖鎖による腎保護機構の解明と腎機能障害マーカーとしての展開
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22K06126
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
森瀬 譲二 京都大学, 医学研究科, 准教授 (60755669)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 非硫酸化型HNK-1糖鎖 / 腎機能障害 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腎臓内糖鎖は様々な腎疾患に伴いその発現パターンが変化することから、その機能的役割の解明が重要な課題となる。特に非硫酸化HNK-1 (nonsulfated human natural killer-1; nsHNK-1)糖鎖は腎臓特異的な発現を示し、かつ尿中にも排泄される糖鎖抗原である。本研究はこのnsHNK-1糖鎖の腎臓における機能的役割およびその発現制御機構の解明を目指すとともに、腎機能障害の早期検出マーカーとしての可能性を探索するものである。
本年度はまず、腎機能障害を早期検出するためのサンドイッチELISAの開発に取り組んだ。尿中nsHNK-1キャリア分子はmeprin αであることがわかっているため、抗meprin α抗体をプレートに固相化し、M6749抗体(抗nsHNK-1抗体)で定量的に検出する方法を試みた。マウス腎臓では老化とともにnsHNK-1発現量が増加することが知られていた一方で、尿中nsHNK-1量は20ヶ月齢より徐々に減少する傾向が新たにわかった。糸球体障害誘導マウスでは誘導3日目より尿中nsHNK-1量が増加した一方で、尿細管障害誘導マウスでは誘導1日目で大きく減少した後に徐々に回復するといった、各腎疾患特異的な尿中nsHNK-1量の変動パターンを捉えることに成功した。さらに糸球体障害誘導マウスおよび尿細管障害誘導マウス血中にもM6749抗体反応性の分子が検出されることが新規にわかった。したがって、本糖鎖抗原は尿だけでなく血中マーカーとしても有用であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の全体の構想として、①nsHNK-1の腎機能に対する役割②nsHNK-1の発現制御機構③腎機能障害を早期検出するためのバイオマーカーとしての展開、これら3つのテーマをもとに研究を進める。
初年度では、③の内容を中心に進めてきた。M6749ハイブリドーマよりM6749抗体を大量に取得し、それをもとにM6749抗体と抗meprin α抗体のサンドイッチELISAを構築した。尿中nsHNK-1量は20ヶ月齢より減少傾向を示したことから、腎機能低下との相関性が見られた。実際にピューロマイシンアミノヌクレオシドを腹腔内投与し糸球体障害を誘導したマウスでは、誘導3日目より尿中nsHNK-1量は増加を示し、それが持続した。腎機能の指標である尿中アルブミン/クレアチニン比(uACR)は誘導1日目より増加しだしたものの、nsHNK-1量はcontrolと比べて4倍近い増加を示したことから、鋭敏な糸球体障害マーカーとして有用である可能性が示唆された。対してアデニン給餌により尿細管障害を誘導したマウスでは、誘導1日目で大きく減少し、4日目よりcontrolと同程度まで回復するといった特徴的な変動を示した。さらにこれら糸球体障害誘導マウスおよび尿細管障害誘導マウスでは、血中M6749抗原が顕著に増加することを新たに見出した。LC/MS解析によりそのキャリア分子をITIH3-ビクニン複合体であることを同定し、かつM6749抗原はnsHNK-1ではなくコンドロイチン硫酸鎖2糖繰り返し構造の末端グルクロン酸であることが示唆された。腎機能障害に伴い増加する糖鎖構造は尿中と血中で異なるものの、M6749抗体単一でそれら糖鎖抗原の増減を追跡できる点で、M6749抗体を用いたELISA法は腎機能障害の早期検出法として有用である可能性を見出した。
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| Strategy for Future Research Activity |
nsHNK-1生合成の責任酵素はグルクロン酸転移酵素GlcAT-Sであり、GlcAT-S遺伝子欠損(SKO)マウスは腎臓内nsHNK-1をほとんど欠失する。このSKOマウスは、老化に伴い顕著なuACRの上昇を示すことが最近わかってきた。すなわち、nsHNK-1は腎保護的な役割を担うことが示唆された。しかしどのようなプロセスでnsHNK-1が腎保護的に働くか、その分子メカニズムについては不明なままである。ただし腎臓内nsHNK-1キャリア分子は膜貫通型メタロプロテアーゼであるmeprin αとaminopeptidase N (APN)の2つが主要であることから、これらがnsHNK-1を介して腎保護的な役割を担う可能性が高いことが予想される。さらにmeprin αとAPNの共通分解基質として繊維化分子であるfibronectinとcollagen IVが挙げられることから、nsHNK-1がそれら活性を調節し、腎繊維化を抑制する働きに貢献している可能性が考えられた。そこで研究の方策として、meprin αとAPNへのnsHNK-1付加によるそれら活性への影響を調べる。具体的には、培養細胞を用いてin vitroでnsHNK-1発現meprin αおよびAPNを作製・精製し、nsHNK-1を発現しないそれら分子との活性の差を調べる。さらにSKOマウス腎切片の蛍光免疫染色で、fibronectinとcollagen IV量が野生型と比べて増加しているかを確かめる。さらにSKOマウスに対して各腎機能障害を誘導し、同様にfibronectinとcollagen IVに対する蛍光免疫染色を行い、間質や糸球体周囲の繊維化量を野生型と比べる。以上の実験を通してnsHNK-1がmeprinやAPNの活性を調節し、繊維化を抑制することで腎機能保護的に働いているメカニズムを示すことを目指す。
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| Causes of Carryover |
理由：腎臓学会で発表予定だった演題が招待講演となり、それに伴う交通費等が不要になったため、当初予定した金額から大きく減った。一方で、物品費については実験の効率化を図ったことと、糸球体障害誘導マウスおよび尿細管障害誘導マウスの血液、尿、腎臓それぞれの試料を有効に使えたため使用数を減らせたことにより、当初予定した金額より下回った。
使用計画：次年度の使用額は当初予定していた研究計画の遂行に使用するとともに、引き続き研究成果の発表を積極的に行う。
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