2022 Fiscal Year Research-status Report
細胞膜との相互作用を介した脂質非対称センシングの分子機構
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22K06141
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
小原 圭介 名古屋大学, 理学研究科, 講師 (30419858)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 細胞膜 / 脂質 / 脂質非対称 / 酵母 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞膜の脂質二重層では、内外層間で脂質分子が不均一に分布している。この様な「脂質非対称」は真核生物に共通の性質であり、この維持や調節が大きく破綻すると細胞一つとして生存できない。研究代表者は、過去に脂質非対称の状態変化を感知して適応反応を引き起こす脂質非対称センサータンパク質Rim21を出芽酵母で同定している。本研究では、Rim21が脂質非対称変化を感知し、下流因子にシグナルを出力する分子機構の解明を試みた。
今年度は、脂質非対称センサーモチーフを内包するRim21のC末端細胞質領域（Rim21C）の組換えタンパク質と脂質との相互作用を調べた。その結果、Rim21Cはホスファチジルセリンやホスファチジン酸などの負電荷を有する脂質に親和性を示し、それらの脂質の脱プロトン化を促す効果があるホスファチジルエタノールアミンがその親和性を高めることを見出した。
また、Rim21が発する脂質非対称シグナル伝達にはユビキチンリガーゼであるRsp5によるユビキチン化が必須である。本研究では、そのユビキチン化に関わるRim21の領域やユビキチン化部位などを調査した。その結果、Rim21C内のPxxYモチーフが脂質非対称シグナル伝達に必要であることが明らかになった。PxxYモチーフはRsp5がユビキチン化のターゲットを認識して結合する際にしばしば用いられるモチーフである。Rsp5のターゲットの少なくとも１つがRim21である可能性を示す結果である。一方、Rsp5が脂質非対称シグナル伝達を媒介するのに必要な領域についても調査を開始した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
Rim21Cと脂質との相互作用の解析には、RIm21Cの組換えタンパク質が必要である。しかし、大腸菌を用いたタンパク質発現系では、Rim21C組換えタンパク質はほとんど発現せず、十分な量が確保できなかった。そこで、様々なタンパク質発現系を試し、最終的にコムギ胚芽抽出液を用いたin vitro転写・翻訳系により、ある程度の量を精製することが出来た。しかし、大規模な実験にはまだ十分ではない。この点がネックになり、Rim21Cと脂質との相互作用の解析には遅れが生じている。
一方、Rim21が下流の夫因子にシグナルを出力する仕組みに関しては、Rim21内の重要なモチーフを新たに見出すことが出来た。また、ユビキチン化を担うRsp5のターゲット認識部位の調査も開始した。Rsp5は機能を失うと細胞が致死になる必須タンパク質であるため、生存に必要な機能を保ちながら、脂質非対称シグナルのみを停止することが出来る点変異体が必要であった。その様な株の構築に苦労したが進展を見た。
総合すると、前進した部分もあるものの停滞している部分もあり、やや遅れているとの判断に至った。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、Rim21Cと脂質の相互作用の解析および下流因子へのシグナル出力機構の解析を行う。
前者については、当面はコムギ胚芽抽出液を用いたin vitro転写・翻訳系を用いてRim21C組換えタンパク質の精製を行いながら、並行してより高収量で精製できるシステムを探索する。十分量の組換えタンパク質を調整できたら、脂質オーバーレイアッセイや人工膜小胞リポソームを用いたpull-dpwnアッセイなどで、脂質との相互作用を調査する。必要に応じて、Rim21C部分に変異を導入した変異組換えタンパク質も精製し、同様にアッセイを行うことで、脂質との相互作用に関わるアミノ酸残基を明らかにしていく。
下流因子へのシグナル出力機構に関しては、今年度に明らかにしたRim21内の重要なモチーフであるPxxYモチーフに変異を導入した株を用いて、シグナル伝達のどの素過程が停止しているかを調べる。これにより、PxxYモチーフが機能する素過程を明らかにする。その他、Rsp5によるユビキチン化のターゲットタンパク質やユビキチン化部位の探索、Rsp5がターゲットを認識する際に用いるドメインの解明などを行う。
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| Causes of Carryover |
Rim21C組換えタンパク質の発現・精製が難航し、脂質の相互作用解析が予定通りに進まなかった。そのため、脂質の相互作用解析に必要な高額な消耗品の購入を行わず、次年度使用額が生じた。
また、私自身や家族のコロナ感染、予期せぬ入試業務などにより、全体として研究にやや遅れが生じている。そのために消耗品費や学会発表の旅費、英語論文の校閲などが予定より低額となり、次年度使用額が生じた。
次年度には、研究にやや遅れが生じている部分を重点的に進め、そのための消耗品費用として次年度使用額を用いる。
また、研究成果の学会発表なども目指す。
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