2023 Fiscal Year Research-status Report
新規構造・基質に基づく細菌S2P膜内切断プロテアーゼの切断制御機構の酵素学的理解
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22K06142
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
檜作 洋平 京都大学, 医生物学研究所, 助教 (70568930)
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2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 大腸菌 / 膜内タンパク質分解 / 膜内切断プロテアーゼ / 金属プロテアーゼ / S2P / 光架橋解析 / パーシスター / small protein |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、大腸菌膜内切断プロテアーゼRsePを研究対象とし、代表者らが明らかにした立体構造や新規切断基質群に基づいて生化学的・酵素学的解析を行うことで、膜内切断の分子機構を解明し、基質ごとの特異性を生み出す普遍的原理を理解することを目的とする。本年度は以下の研究成果を得た。
■RsePの膜内ゲート構造に着目した基質切断制御機構の解析：前年度の研究では、RsePが膜中にゲート構造を形成し、このゲートの構造変化を介して基質の取り込み・切断を促進するという新たな基質切断制御モデルを提案し、発表した。今年度はこのモデルのさらなる検証として以下の実験を実施した。1) in vivoでの分子内ジスルフィド架橋解析を行い、ゲートを構成するTM4領域の生体内における立体配置を推定した。2) 加水分解に必要とされる膜中触媒部位周辺の親水性区画の変異体機能解析を行い、基質切断に影響を与える新規の変異を見出した。3) RsePと基質の相互作用様式を調べるためにTM4全域を対象とした部位特異的in vivo光架橋解析を行い、基質と近接する部位を複数同定した。以上の結果は切断制御モデルを支持しつつ、基質取り込みから結合に至る過程におけるゲートTM4領域の構造変化プロセスの実態を明らかにするものである。
■RsePの新規生理基質群の同定とその切断の生理的意義の解明：これまでにRsePの新規基質及び生理機能の探索を試み、10種ほどの小分子膜タンパク質（SMPs）を基質候補として選出している。本研究ではこれら候補群の詳細な解析を行い、14種のSMPsを新規基質候補として同定した。そのうち細胞のパーシスター化に関わる内在性トキシンであるHokBの機能解析を行い、RsePがHokBを切断・分解することでその細胞毒性を抑制することを示した。これらの成果を論文にまとめ、学術雑誌mBio上で発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題は、3つの研究項目からなるため、それぞれの項目について評価する。項目【1】．「RsePの新規X線結晶構造に基づく機能制御機構の解析」では、昨年度に発表した論文において提唱した、ゲート構造の構造変化を介したRsePの基質取り込み・切断制御機構モデルをさらに強固なものとするため、光架橋解析などによる構造―機能相関解析を行い、提案モデルを支持する結果を得たと同時に、ゲートの構造変化時のゲート構成ドメインと基質の残基レベルでの相互作用様式についても知見を得た。これらの成果は本項目の目的である膜内切断制御機構の分子的理解をさらに推し進めるものであり、順調な進捗状況であると言える。次に項目【3】．「新規切断基質群を用いた系統的切断解析」に関して、本年度は多様な基質群の系統的解析という本項目の解析基盤となる新規基質候補群SMPsについて重点的な解析を行い、学術論文として発表した。本成果は昨年度から並行して実施している基質スワッピング解析などの系統的変異解析の結果を改めて保証するものであり、着実な進展と捉えている。また、本論文で発表したHokBの機能発現におけるRsePの役割については、細菌パーシスター化制御にRsePが関与する可能性を示唆するものである。パーシスター化は細菌感染時の病原性発揮や難治療化とも密接に関わることから、本課題の将来展望と言える、感染症治療を見据えたRseP阻害剤開発の重要性をより強く支持するものであり、本課題の研究意義を押し上げるものと言えよう。最後に項目【2】．「定量的in vitro酵素活性測定法の構築とそれを用いたkinetics解析」については、本年度は項目【3】の成果発表に向けたとりまとめの解析などを優先したため、あまり進展は見られなかった。以上を総合的に判断して、本課題は当初の研究計画に沿って順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
【現在までの進捗状況】の項目で記載した通り、ここまで着実に学術論文として成果を発表しつつ、概ね研究計画通りに進展している。そのため本研究課題の最終年度となる次年度も、引き続き研究計画に沿って研究を進め、成果を取りまとめて論文としての発表を目指す。まず項目【1】では、基質取り込み時のRsePと基質との相互作用様式について、残基レベルでの結合部位が得られつつあるので、ゲート部位の変異やプロテアーゼ活性を欠損するような変異を導入した変異体でin vivo光架橋解析や修飾実験、共免疫沈降解析等によるRsePと基質の相互作用解析を行うことで、基質取り込み時のゲートの構造変化の動的ステップの詳細を明らかにする。項目【2】に関しては、構築済みのFRET蛍光標識基質ペプチドを用いて、精製RsePの定量的in vitro活性測定系を確立し、【1】で構築された制御機構モデルに基づいた各種RseP変異体の酵素反応速度論的（kinetics）解析を行うことで、モデルを実証しつつ、RsePの酵素学的特性を明らかにする。項目【3】では、昨年度までに実施した基質スワッピング解析等の系統的解析をさらに進め、切断促進／忌避モチーフといった基質に共通する特徴や、基質ごとの特異性を決定する要素を明らかにする。また、新たに同定したSMPsなどの基質も含め、部位特異的光架橋法を用いてRsePと各基質との相互作用解析を行うことで、RsePの基質特異的な認識機構の理解を目指す。
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| Causes of Carryover |
今年度の使用状況：主として以下の理由で次年度使用額が生じた。（物品費）今年度は遺伝学的・生化学的解析が主となり、研究室の保有機器・試薬、消耗品等を使用することで物品費を抑えつつ研究を遂行した。（旅費）国際学会（シンガポール）への参加があり、当初の見込み以上の費用が掛かったものの、開催時期が重なった国内研究会への参加を見送ったこと、他の国内学会へも大学院生等の参加がなかったこと、またウイルス感染対策として共同研究の打ち合わせ等がほとんどWEB会議へと移行したこと等から、出張関連費の使用額が減少した。（謝金）国際学術誌に投稿する論文作成に関連する英文校閲費等を見込んでいたが、他の研究助成金を使用したために不要となった。（その他）同じく論文投稿・掲載料を見込んでいたが不要となった。また、in vitro酵素活性測定に必要となる蛍光ペプチドの合成委託費を見込んでいたが、今年度はほとんど未着手となったために使用額が減少した。
次年度の使用計画：申請時当初の諸費用に加え、以下を計上する予定である。in vitro酵素活性測定に必要なタンパク質精製に掛かる培地、界面活性剤、特異的抗体、クロマトグラフィ用カラム等の関連費を物品費に計上し、研究項目【2】を注力して行うため、蛍光ペプチドの合成委託費を上乗せしてその他に計上する。論文作成に掛かる英文校閲費を謝金に、論文投稿・掲載料をその他に計上する。
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[Presentation] Structure-based gating model for substrate accommodation and intramembrane proteolysis of E. coli site-2 protease (S2P), RseP2023
Author(s)
Hizukuri, Y., Imaizumi, Y., Takanuki, K., Miyake, T., Kobayashi, T., Yokoyama, T., Oi, R., Nogi, T., Akiyama, Y.
Organizer
12th General Meeting of the International Proteolysis Society
Int'l Joint Research
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