2023 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of the molecular mechanism of reduction of protein secretion in peptide:N-glycanase deficient cells
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22K06155
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
平山 弘人 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 研究員 (50525847)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | NGLY1 / PNGase / 細胞内輸送 / 糖鎖修飾 / 糖鎖代謝 / 小胞体 / 細胞質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞質ペプチド:N-グリカーゼ(PNGase，哺乳動物ではNGLY1)は糖タンパク質からN-結合型糖鎖を脱離する反応を触媒するアミダーゼであり，真核生物に広く保存 されていることが知られている。新生糖タンパク質は小胞体内腔で正しく折り畳まれた後に，そのタンパク質が機能を発揮する場所へと輸送される。一方，新たに合成された糖タンパ ク質のうち，正しい折りたたみ構造をとることが出来なかった異常糖タンパク質は小胞体品質管理機構(ERQC)によって選別され，細胞質へと逆行輸送された後 に，ユビキチンープロテアソームによって分解される。小胞体関連分解(ERAD)と呼ばれるこの経路の中で細胞質PNGaseはかさ高く表面積のの大きいN-結合型糖鎖 をタンパク質から脱離することによって，筒状構造をとっているプロテアソームにおけるタンパク質の分解効率を向上させていると考えられている。我々はNGLY1欠損HeLa細胞(NGLY1-KO細胞)で細胞外への分泌が減少しているタンパク質を複数見出し，その中でwntシグナルの調節に関わるタンパク 質DKK1に着目し，解析を進めている。現在までに，DKK1の発現減少は遺伝子転写レベルではみられないことを確認している。このことから，本タンパク質は翻訳後，なんらかの理由で細胞外への分泌が減少していることが予想された。そこで我々は，FLAGタグを付加したDKK1をHeLa細胞に発現させてその細胞外への分泌異 常のメカニズムを詳細に解析することとした。その結果，分泌異常だけでなく，細胞外へと分泌されたFLAG-DKK1はNGLY1-KO細胞由来の野生株のものと比べる と，若干の分子量増加が見られた。そこで，この分子量変化に着目しそのメカニズムを明らかにするための解析を実施している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
GLY1-KO細胞由来のDKK1で分子量の増加が見られたものの，その差がわずかであるために，SDS-PAGEによる分離を行う際のSDS-PAGEの泳動条件の検討，サイズの 大きいゲルを使用することによる分離の向上等を試みたものの，分離の差を明瞭にすることが困難であった。最終的には，ゲルの分離濃度と泳動時間を至適化することによって，明瞭にバンドサイズを区別することに成功した。DKK1はN-およびO-結合型糖鎖の修飾を受けることが知られており，細胞内に存在 するDKK1と細胞外に分泌されたDKK1ではその糖鎖構造の差により分子量に大きな違いが生じることが知られている(細胞内DKK1の分子量:30kDa, 分泌型DKK1の分 子量:40kDa)。この分子量増加の原因がN-結合型糖鎖由来のものであるかを検討するために，DKK1からPNGaseF処理によりN-結合型糖鎖を脱離し分子量を比較し た。しかしながらNGLY1-KO細胞由来のDKK1では未だ分子量の増加が見られた。このことから，DKK1の分子量増加はO-結合型糖鎖修飾の変化または他の翻訳後修飾 による可能性が強く示唆された。また，NGLY1-KO細胞では，DKK1の形成するS-S結合の形成に 異常が生じているのではないかと考えて，フリーのcysteinを修飾するPEG-PCMalによって解析を行った。その結果，WTではフリーのcystein が野生株に比べて多く存在することを示唆するデータを得た。これらの結果から，NGLY1欠損細胞では何らかの要因によってDKK1の折りたたみが正しく行われていない可能性が示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
上述の結果から，NGLY1-KO細胞ではDKK1が正しい折りたたみ構造をとれず，その結果,
タンパク質の表面に露出した領域に何らかの修飾が生じて分子量が増加している可能性が示唆された。今後はNGLY1-KO細胞に発現するDKK1のフォールディング状態および修飾について解析を進めてく予定である。
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| Causes of Carryover |
当初予定していた研究計画通りに進まなかったため，予算の執行が滞ってしまった。
次年度の研究を進めることで計画通りの予算の執行に努めたい。
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