2022 Fiscal Year Research-status Report
verification of the back-door model for actin phasphate release
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22K06172
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| Research Institution | Tokai Gakuin University |
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Principal Investigator |
小田 俊郎 東海学院大学, 健康福祉学部, 教授(移行) (20321739)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
太田 元規 名古屋大学, 情報学研究科, 教授 (40290895)
武田 修一 岡山大学, 異分野基礎科学研究所, 特任助教 (50509081)
岩佐 充貞 名古屋大学, 情報学研究科, 協力研究員 (60509082)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | アクチン / ATPase / Pi放出 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度は、高分解能繊維型コンフォメーションアクチンの結晶構造とそれに基づく量子化学計算をもとに、アクチンのATP加水分解機構を議論した論文「Structures and mechanisms of actin ATP hydrolysis」をPNAS発表した。また、Pi放出穴の蓋（バックドア）に相当するArg177が相互作用するHis161に注目し、その側鎖のフリッピングを制御するPro-rich-loopのアクチン変異体を調製して生化学実験・結晶構造解析を行い、論文「Mutagenic analysis of actin reveals the mechanism of His161 flipping that triggers ATP hydrolysis」を発表した。現在進行中の研究の進捗状況は以下の通り。1.アクチンの加水分解とPi放出の両方に影響を与えるであろうヌクレオチド結合カチオンがアクチン構造に与える影響を、SPring-8にて結晶構造解析を行って検討した。まだ、明瞭な結論はいられていない。2.既存の結晶構造をもとにPro-rich loopの形状を検討し、PＬ-F型とPＬ-G型があることを発見した。サイトカラシン-アクチンでは分子全体はG型であるにも関わらず、Pro-rich-loopはPＬ-F型であることを見つけた（全体構造と必ずしも対応しない）。MDシミュレーションを用いて、相補的ストランドの182-194のヘリックスが結合していないB端では、分子全体がF型でも、PＬ-G型になることを見出した。さらなる検討が必要である。また、アクチン発現系の改良のため、RosenらのNMRの論文にある、N末にHisタグとThymosin-beta4を付けてTEVで切るコンストラクトを調製し、可溶性発現アクチンが増加することを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
課題Ⅰと課題Ⅱに関して：アクチン発現量の改善などのために、バキュロウイルスを用いたアクチン発現系（改良型）の構築を試み、従来型の発現系と比べてより多くの可溶性発現アクチンを確認した。その際、RosenらのNMRの論文にある、N末にHisタグとThymosin-beta4を付けてTEVで切るコンストラクトを用いた。生化学・発現実験の拠点としている名大の成田研究室があるG館の耐震工事のため、昨年の年末から一時的に研究室を引っ越している。そのため、発現実験を行うことができず、計画が少し遅れている。
課題Ⅲに関して：フラグミン-アクチン結晶ではアクチンの全体構造はF型であり、ヌクレオチドはADP/Piであるが、Latrunculinをソーキングすることにより全体構造がG型に変わることを見出している。GアクチンではPiを保持できないので、その過程を結晶構造解析によって観察すればPi放出過程を検討できると思われる。その前段階として、F型アクチンでPiと周辺残基や水分子との結合の安定性を検討するために、ヌクレオチドに結合するカチオン（Ba、Mg、Ca等）を変え構造に摂動を加え、結晶構造解析を行った。
課題Ⅳに関して：Fアクチン6djmやF2A4のFアクチン様アクチン-フラグミン複合体をもとに本格的にMDを行った。相補的ストランドのアクチンの182-194のαヘリックスがPro-rich loopに結合しているかに依存して、放出穴の開閉が決まることがわかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題Ⅰと課題Ⅱに関して：6月に校舎の耐震工事が終了して、成田研究室がG館に戻る。できるだけ速やかに発現実験を再開する。本年度は、発現アクチンの精製方法を確立し、各種解析のための実験系の構築とアクチン変異体の調製に着手する予定である。我々が提案しているN111の変異体を用いた類似の変異体実験がRunserのグループによるプレプリントとして最近発表されたため、穴の開閉ではなく、開閉の制御に主眼を転換してその解明のために必要な変異体を構築する。
課題Ⅲに関して：昨年度に行った、ヌクレオチドに結合するカチオン（Ba、Mg、Ca等）による摂動を加えたアクチン構造の解析を引き続き行い、構造を得る。また、Latrunculinのソーキング実験の準備を行う。
課題Ⅳに関して：昨年度、Fアクチン6djmやF2A4のFアクチン様アクチン-フラグミン複合体をもとに本格的にMDを行った。さらに、このMDを長時間化して、穴の開閉とC末端を繋ぐ水素結合ネットワークの解明に努める。また、放出穴の開閉と相関するPro-rich loopの構造分類など、これまでに得られた結果を早急に発表する。
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| Causes of Carryover |
昨年度、研究を開始するにあたり新規に購入するものが想定外に生じる可能性を考え、次年度への持ち越しが可能であることも考慮にいれ、通常のランニングコストより多めに申請した。しかし、研究室が耐震工事のために生化学・発現実験を進めることができず、未使用が発生した。6月から研究室が使用可能になるため、計画にもとづいて研究を進める。研究計画に大きな変更はない。
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[Journal Article] Structures and mechanisms of actin ATP hydrolysis2022
Author(s)
Kanematsu Yusuke、Narita Akihiro、Oda Toshiro、Koike Ryotaro、Ota Motonori、Takano Yu、Moritsugu Kei、Fujiwara Ikuko、Tanaka Kotaro、Komatsu Hideyuki、Nagae Takayuki、Watanabe Nobuhisa、Iwasa Mitsusada、Ma?da Yuichiro、Takeda Shuichi
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Journal Title
Proceedings of the National Academy of Sciences
Volume: 119
Pages: e2122641119-
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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