2022 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of a gene silencing system within the budding yeast retrotransposon
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22K06183
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
増本 博司 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医歯薬学総合研究系), 講師 (80423151)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
仁木 宏典 国立遺伝学研究所, 遺伝形質研究系, 教授 (70208122)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | レトロトランスポゾン / 遺伝子サイレンシング / クロマチン構造 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は出芽酵母レトロトランスポゾンTy1のGAG遺伝子内部に存在する逆繰り返し配列（inverted repeat（IR）配列）を中心とした遺伝子サイレンシング機構の解明を試みている。
本年度はTy1内部にIR配列を中心としたサイレンシング様クロマチンがTy1の転写制御における役割を明らかにした。Ty1は両端においてプロモーター・ターミネーターを兼務するlong-terminal repeat (LTR)配列で挟まれ、遺伝子転写開始点はGAG遺伝子の5’端となるはずである。しかし転写制御因子群の認識部位はGAG遺伝子配列内部、IR配列にまで広がっている。さらにIR配列はTy1のshort formであるTy1iの開始点でもあった。データベース上で公開されている次世代シーケンサーデータ（Badjatia, N., et al. Cell Rep. 2021）から、Ty1周辺のヌクレオソーム位置、ヒストンの修飾の分布状態を調べた。その結果、IR配列を起点に上流側はヌクレオソームがまばらに形成され、転写制御因子群が結合配列を認識・結合できるnucleosome-free領域、IR配列より下流側は遺伝子本体領域でみられるヌクレオソームが密に配置されたクロマチン領域を形成していた。またプロモーター領域から遺伝子上流領域で形成され、遺伝子転写活性化に必要なヒストンのアセチル化・メチル化修飾、IR配列以降は遺伝子本体領域でみられるヒストンメチル化修飾が検出された。これらの結果から、IR配列の役割はTy1内部で起こるプロモーター領域・遺伝子領域を分けるクロマチン構造を本来のGAG遺伝子開始点ではなく、GAG遺伝子内部で形成させる役割を担っている。このようにIR配列を中心とするサイレンシング制御ドメインが、遺伝子開始点を強制的に移動させる制御機構として機能することを示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. データベース上で公開されている Chromatin immunoprecipitation-sequence (ChIP-seq)データ（Badjatia, N., et al. Cell Rep. 2021）から、 IR配列が境界となり、その5’上流側をヌクレオソームが自由にスライド移動できるnucleosome-free 領域, IR配列下流側ではヌクレオソーム構造が密に配置された構造を取っている。この密なヌクレオソーム配置が下流遺伝子のプロモーター領域への転写因子の結合を阻害し、遺伝子サイレンシグを起こすと推測される。
2. Ty1では本来のプロモーター領域からGAG遺伝子内部にあるIR配列上流にまでTy1自身の転写制御因子の結合部位が存在する。IR配列の下流側では遺伝子本体のクロマチンに特徴的なヒストンH3のトリメチル化が起こり、IR配列の上流側では転写が活発なプロモーター領域に特徴的なヒストンH3のトリメチル化、およびヒストンのアセチル化が検出された。このことはIR配列のクロマチン境界形成の役割が、本来GAG遺伝子の5’末端で形成される始めのヌクレオソーム（+1 ヌクレオソーム）をIR配列部位下流に強制的に配置させることでGAG遺伝子内部まで広がる転写制御領域を有効に活用していることを示唆している。
3. IR配列を中心としたサイレンシングを司る因子のスクリーニングを行い、現在のところ機能が未知であるMSC3遺伝子を単離した。この遺伝子への変異はサイレンシング効果の喪失につながる。ChIP-assay法を使った解析の結果、IR配列の上流領域を欠損させた場合、Msc3はIR配列に局在するが、IR配列の上流領域が存在する場合、Msc3のIR配列への結合は確認できなかった。
このようにGAGsi配列のクロマチン構造での特徴を明らかにできており、順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後IR配列が果たすnucleosome-free領域、遺伝子領域で形成される密なクロマチン構造を分ける境界としての機能の解明を試みる。Bisulfate-seqの結果ではIR配列は染色体上ではループ構造といった二次構造は形成されていないが、IR配列でNFR領域から密なヌクレオソーム配置へと切り替わる転換点を形成している。本研究ではIR配列に直接結合、新規クロマチン形成を行う因子の解析を継続して行う。今回スクリーニングで得られたMsc3に関して、その遺伝子変異によってサイレンシング効果の解除を、IR配列を中心としたクロマチン境界の崩壊について、ヌクレオソーム配置の解析をヌクレオソーム構成因子であるヒストンに対するChIP assayを用いて解析していく。さらにはMsc3以外にもIR配列およびその下流のサイレンシング制御領域に結合できる因子をスクリーニングしていく予定である。Msc3を含め同定予定のサイレンシング効果に関与する因子群については、ChIP-seqを用いてTy1トランスポゾン以外の結合部位を調べ、周辺の遺伝子群に対するサイレンシング効果の有無を調べていく予定である。
今回明らかになった転写サイレンシング制御は、サイレンシング制御領域が250 ntと小さく、その上流から進行してきた転写フォークによってサイレンシング効果が解除される特徴がある。IR配列を中心としたサイレンシング制御領域＋遺伝子プロモーター領域＋遺伝子配列を使い、様々な遺伝子の転写をオン・オフできる技術の開発を行っていく。
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| Causes of Carryover |
本年度は遺伝子のスクリーニングなど、時間がかかるが低予算で実行できる実験が多く、さらにはChIP-seq解析に関して一部の工程を外部企業に委託することで研究費のコストダウンを行うことができた。そのため本年度の予算の一部を次年度に持ち越した。
次年度はChiP-seq解析に加えて、論文の投稿料などが生じるため、本年度の余剰分を充てる予定である。
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