2022 Fiscal Year Research-status Report

Finding of functional lncRNAs using newly developed RADCL-IP-seq technology

Research Project

Project/Area Number	22K06187
Research Institution	Institute of Physical and Chemical Research
Principal Investigator	加藤雅紀国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 上級研究員 (10625437)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	ノンコーディングRNA / クロマチン / エピジェネティクス
Outline of Annual Research Achievements	ヒトでは約28,000種のノンコーディングRNA (ncRNA), 長鎖ncRNA (lncRNA)が存在するが、ほとんどの機能は明らかになっていない。機能が明らかなlncRNAではlncRNAがクロマチンに結合し、ポリコーム複合体をリクルートすることで高次クロマチン構造を形成する例が知られている。本研究ではRNAとクロマチンの相互作用をゲノムワイドに網羅的に検出する系であるRADICL-seq法を応用し、抗ヒストン修飾抗体などによる免疫沈降法と組み合わせる手法(RADICL-IP法)を開発し、染色体高次構造に重要な役割をもつRNAおよびlncRNAを探索する。本年度はRADICL-IP法プロトコールの開発を行なった。プロトコール開発にあたり必要な条件検討を行なった。プロトコールではDNase Iによるゲノムの切断を行ったのちアダプターを介し核内RNAとゲノムDNAをライゲーションさせ、免疫沈降前にソニケーションし核膜を破砕する。RNAはソニケーションに弱いため、ソニケーション条件の検討を行なった。また免疫沈降後の収量が少ないため、細胞数の検討、および使用する抗体の検討を行なったところ抗H3K27me3抗体では安定的にライブラリーを作成できることが明らかとなった。マウスES細胞を用いてinputおよびH3K27me3-RADICL-IPライブラリーを作成し、次世代シーケンサーMiseqを用いてライブラリーのクオリティチェックを行ったところ良好な結果が得られた。よってHiseqを用いて大量データを取得した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 抗H3K27me3抗体を用いたRADICL-seq の応用系(RADICL-IP法)のプロトコールはほぼ完成したため
Strategy for Future Research Activity	本年度はRADICL-seq 法の応用系の開発として特定の抗体による濃縮を組み合わせることによって、特定の領域を高感度で検出する系（RADICL-IP）の開発を行った。H3K27me3-RADICL-IPライブラリーを作成しHiseqを用いて大量のデータを取得できたため今後解析を行い、ライブラリー作成の改良に役立てる。Inputライブラリーとの比較によりどのようなRNA, 特にlncRNAがH3K27me3-RADICL-IPライブラリーで濃縮されているかを探索しH3K27me3修飾、ポリコームとRNAのクロマチン結合との関わりについて解析を行う。免疫沈降後の収量の低い抗体に関しては引き続き収量をあげるべく検討を行う。
Causes of Carryover	Novaseqシーケンス費用として次年度の予算と合わせて使用するため