2023 Fiscal Year Research-status Report
ヒストンの受け渡し活性測定系の開発から探索するヒストンリサイクルの分子機構
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22K06210
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
日詰 光治 埼玉医科大学, 医学部, 講師 (10378846)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | DNA複製 / ヌクレオソーム / クロマチン / ヒストン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
精製したMcm2のN末領域（Mcm2N)とコアヒストン八量体との試験管内結合実験を進めたところ、八量体からH2A-H2B二量体が脱落したコアヒストン六量体とMcm2Nとが複合体を形成することを見出した。更に、この複合体にヒストンシャペロンFACTを加えると、結合する様子が検出された。一方で、FACTと同じくMcm2N、ヒストンと複合体を作ることが報告されているAsf1を添加しても、Mcm2N-ヒストン結合には影響せず、またAsf1がそこに相互作用することもなかった。
また、Mcm2Nは、保持したヒストン六量体をNap1存在下で解離させることもわかった。一方で、Mcm2N-ヒストン六量体複合体にDNAを加えると、凝集体を形成した。Mcm2N-ヒストン複合体にNap1を加えたうえで、DNAを添加すると、ヌクレオソームが形成される様子も検出した。
以上の結果から、ヒストンリサイクルのためにヒストンを保持したMcm2Nから、まずNap1などのシャペロンがヒストンを剥がし、そのうえでDNAにヒストンを供給してヌクレオソームを形成させるという、ヒストンの受け渡しのステップの存在が示唆された。
なお、DNA上にMcm2Nを固定してヒストンリサイクルを進めるために、SOS-boxを含むDNA上にLexA-Mcm2Nを固定した状態でコアヒストンを加える、あるいは、コアヒストンとLexA-Mcm2Nを混合したうえで、DNAを加えるなどの実験をしたが、いずれも混合した因子が凝集し、その先のヒストン受け渡し反応を進めるに至っていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DNA上に固定したMcm2Nを利用してヒストンリサイクルを追跡するという当初の計画はうまくいかず、固定していないMcm2Nを用いて研究を進めている。しかし、その条件下において、各種ヒストンサイクル因子を添加する実験を行い、Mcm2N→Nap1というヒストンの授受が行われる様子が検出されている。当初の計画通りではないが、順調に解析結果は積み重ねられているため、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、引き続きDNA上に固定したMcm2Nでのヒストンリサイクルの系の確立を目指す。エキソヌクレアーゼを利用してDNA断片の一部だけを分解し、そこに形成させたヌクレオソームを解離させる系を確立して、そのヌクレオソームから遊離したヒストンをMcm2Nが保持できるかどうかの測定を行うことを目指すなど、系の確立とそれを用いた解析を実施する。
また、既に進めている遊離Mcm2Nを用いた解析も進める。Mcm2のN末領域はリン酸化修飾を細胞周期依存的に受けるので、それとヒストン結合や解離への影響を調べる。
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| Causes of Carryover |
初年度に購入を見送ったUVモニターと、COVID19による学会参加見送りの影響で、繰り越しがあった。また、二年度目にあたる2023年度は、当初予算に対して執行が７０％となったが、これは当初計画していた実験補助員の雇用を適任者が見つからずに見送り、その分プラスミド構築を外注するなどして効率化を図ったことから、当初予算とは差異が生じた。
次年度使用額は、適任者がいた場合は実験補助員の雇用、あるいは作業効率化のためのソフトウェアの購入などに充当する。
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