2022 Fiscal Year Research-status Report
Functional background of mitochondrial genome evolution unraveled from the atp8 gene of Polypedates leucomystax
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22K06348
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
安岡 有理 国立研究開発法人理化学研究所, 生命医科学研究センター, 研究員 (70724954)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山田 勇磨 北海道大学, 薬学研究院, 准教授 (60451431)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア / ゲノム編集 / 進化 / シロアゴガエル / ツメガエル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【計画１】ゲノム編集によるネッタイツメガエルMitoゲノム変異体の作出
ヒトミトコンドリア局在配列がツメガエル細胞で十分機能することをツメガエル培養細胞で確認したのち、ミトコンドリア局在型Cas9とRP-loop付きsgRNAをツメガエル胚に顕微注入したが、ミトコンドリアゲノムに変異が導入された形跡は認められなかった。また、RP-loop配列のミトコンドリア局在に対する有効性を調べるためにヒト培養細胞やツメガエル培養細胞を用いたRNAトランスフェクション実験を行ったが、RP-loopなしでもミトコンドリア画分から大量のsgRNAが検出されてしまったので、実験系の再検討が必要となった。なお、抗Cox4抗体を用いることでツメガエルミトコンドリアを抗体染色にて可視化する方法も確立した。
【計画２】MITO-Porterを用いたMitoゲノム遺伝子の機能解析
ミトコンドリア用に遺伝子コードを改変したmVenus mRNAを作成し、MITO-Porterに封入してツメガエル胚に顕微注入したが、蛍光観察・ウェスタンブロッティングどちらでも発現を認められなかった。また、MITO-Porterに導入した蛍光色素を観察しても、明瞭なミトコンドリアへの局在は確認できなかった。
【計画３】シロアゴガエル全ゲノム配列の解読
一分子ロングリードシークエンサー（PacBio Sequel II HiFiリード）を用いて、シロアゴガエルの全ゲノム解読を行った結果、良好なゲノムアセンブリが得られた（Scaffod N50=1.46Mb, complete BUSCOs=94.8%）。トランスクリプトームデータと合わせて解析した結果、シロアゴガエルミトコンドリア関連遺伝子には目立った重複がないこと、atp8遺伝子が核に移行した形跡はないこと、これまで偽遺伝子だと思われてきたatp8が十分に転写されていることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【計画１】ゲノム編集によるネッタイツメガエルMitoゲノム変異体の作出
ミトコンドリアゲノム編集個体の作出には至らなかったが、各種コンストラクトの作成や、ツメガエル胚ミトコンドリアに対する抗体染色法の確立、培養細胞を用いたミトコンドリアRNAの評価系の検討など、次年度以降の基礎となる実験結果を数多く得られた。また、遺伝子改変したオタマジャクシを飼育して次世代を得るための準備もできた。
【計画２】MITO-Porterを用いたMitoゲノム遺伝子の機能解析
mRNAを研究代表者が作成し、研究分担者がそれをMITO-Porterに封入、そして研究代表者がそのMITO-Porterをツメガエル胚へ顕微注入する、という一連の流れを確立できた。MITO-Porterの顕微注入による動物胚でのミトコンドリア遺伝子機能解析という初めての試みに向けてまず第一歩を踏み出せた。
【計画３】シロアゴガエル全ゲノム配列の解読
シロアゴガエルのゲノム・トランスクリプトーム解析は順調に進んでおり、一見異常な配列をもつシロアゴガエルAtp8が正常に機能している可能性が強く支持されるという、既報を覆す結果を得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
【計画１】ゲノム編集によるネッタイツメガエルMitoゲノム変異体の作出
ツメガエル胚へ顕微注入したミトコンドリア局在型Cas9がミトコンドリアへ局在しているのか、抗体染色もしくはトランスジェニック個体を用いた観察で評価する。あるいはミトコンドリア画分のウェスタンブロッティングで確認する。RP-loop付きsgRNAの局在評価については、LipofectionではなくElectroporationによって細胞へとsgRNAを導入し、顕微注入に近い状況を作り出した上でミトコンドリアへの局在を検討する。また、ミトコンドリア画分をRNase処理することで、ミトコンドリア外膜に付着したRNAを除去し、ミトコンドリア内部のRNAのみを評価できるようにする。ツメガエル胚でヒトRP-loopが機能しないようなら、ツメガエルRP-loop配列の導入を検討する。
【計画２】MITO-Porterを用いたMitoゲノム遺伝子の機能解析
MITO-Porterを再度作成し、外来ミトコンドリアRNAによる遺伝子発現に挑戦する。MITO-Porterそのものや封入されたRNAがミトコンドリアに局在しているかどうかは、ツメガエル胚と培養細胞を用いたミトコンドリア分画RT-qPCRで検討する。
【計画３】シロアゴガエル全ゲノム配列の解読
シロアゴガエルゲノム解読については、遺伝子アノテーションや遺伝子レパートリーの解析などの解析を行うことで、シロアゴガエルゲノムの特徴を洗い出す。また、ATP8遺伝子を欠損するヒト細胞株を用いて、シロアゴガエルAtp8がヒトATP8と同様に複合体形成をレスキューできるのかを検討することで、その機能を評価する。
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| Causes of Carryover |
少額の予算を次年度使用額とすることで、効率的な予算執行を図った。
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Research Products
(9 results)
