2023 Fiscal Year Research-status Report
The molecular basis of gene expression regulation by a super-long range cis-regulatory element
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22K06426
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
岩田 哲郎 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (30771563)
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2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 嗅覚受容体遺伝子 / 発現制御領域 / 長距離エンハンサー / エピジェネティック修飾 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ClassⅠタイプ嗅覚受容体を発現する嗅神経細胞特異的なエピジェネティックプロファイルを明らかにするため、昨年度から継続してFACSにより分取したClassⅠ発現嗅神経細胞を用いてATAC-sequencingを実施し、網羅的オープンクロマチンデータ（合計2 biological replicates）を取得した。このデータを、公開されている全成熟嗅神経細胞（大多数はClassⅡタイプ嗅覚受容体を発現する嗅神経細胞）のデータと比較することによって、ClassⅠ嗅覚受容体遺伝子クラスターの近傍にClassⅠ発現嗅神経細胞でのみ特異的にピークが認められる領域、すなわちJ-element以外のClassⅠエンハンサー候補領域を見出した。候補領域の機能を明らかにするため、CRISPR-Cas9により欠失マウスを作出し、遺伝子発現解析に取り掛かっている。また、ClassⅠ発現嗅神経細胞におけるヒストン修飾プロファイルを明らかにするため解析条件を検討した。FACSにより分取できるClassⅠ発現嗅神経細胞数は少数のため通常のChIP-sequencing法は難しいと考え、CUT&Tag法を用いて、まず構成的ヘテロクロマチン修飾（H3K9me3）の解析を試みた。FACS前に酵素による分散処理をしているために使用した細胞数に対して取得ピーク量が少ない可能性があったが、修飾レベルを調べるには十分信頼できると考えられた。今後はこのアッセイ法によりユークロマチン修飾（H3K27ac）も解析するとともに、全成熟嗅神経細胞（コントロール）に対しても同様に解析を進め、修飾レベルの比較をおこなう予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は主にClassⅠ発現嗅神経細胞のエピジェネティック解析を進め、網羅的オープンクロマチンデータ（n=2）の解析を実施した。この解析から未だ明らかになっていない新たなClassⅠエンハンサー候補領域を見出し、欠失マウスを作出してその機能解析に着手した。ヒストン修飾解析については、CUT&Tag法による構成的ヘテロクロマチン修飾（H3K9me3）の解析を通して、現状FACSにより収集できるClassⅠ発現嗅神経細胞数でも実施できる目処がついた。また、J-element中の新規コンセンサスモチーフの解析に関しては、昨年度中に作出した欠失マウスの遺伝子発現解析（RNA-sequencing）を実施し、より詳細な解析を進めている。以上の点から、一定の進捗と成果が得られており、総合しておおむね順調であると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
ClassⅠ発現嗅神経細胞におけるヒストン修飾プロファイルを明らかにするために、構成的ヘテロクロマチン修飾（H3K9me3）およびユークロマチン修飾（H3K27ac）を対象とし、FACSにより収集したClassⅠ発現嗅神経細胞ならびに全成熟嗅神経細胞（ClassⅡ発現嗅神経細胞のプロファイルを反映）もコントロールとして解析を進める。これらのデータは、別途解析を進めている新たなClassⅠエンハンサー候補領域を見出すにも役立つ。最終年度となるため、ClassⅠ発現嗅神経細胞のエピジェネティック解析ならびにJ-element中の新規コンセンサスモチーフの機能解析を進めることで、長距離発現制御を可能にする分子基盤を明らかにし、論文化を目指す。
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| Causes of Carryover |
ClassⅠ発現嗅神経細胞の網羅的ヒストン修飾解析の手法として、比較したい先行研究の全成熟嗅神経細胞の解析で実施されていたChIP-sequencing法を計画していたが、取得できる細胞数の問題からCUT&Tag法が適応できるかを検討した。次年度に、少なくとも構成的ヘテロクロマチン修飾とユークロマチン修飾を、ClassⅠ発現嗅神経細胞ならびに全成熟嗅神経細胞の２集団に対して実施する必要があり、これらのエピジェネティック解析に充当していく予定である。
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