哺乳類脳内興奮性神経伝達の新規律速段階過程の探究

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K06449
• Research Institution: Doshisha University
• Principal Investigator: 河野 洋幸 同志社大学, 研究開発推進機構, 助教 (10736218)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: シナプス伝達

Outline of Annual Research Achievements

脳内興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸は、小胞膜上の液胞型プロトンATPase（V-ATPase）が形成するプロトン電気化学勾配によって駆動されるが、グルタミン酸が小胞内プロトン動態に及ぼす影響は不明である。申請者は、グルタミン酸を小胞内に取り込む小胞型グルタミン酸トランスポーター（VGLUT）を阻害するために、海馬における主たるイソ型であるVGLUT1ノックアウトマウスの海馬ニューロンを培養し、さらに、海馬はVGLUT2を共発現するニューロンが混在するため、VGLUT2をノックダウンさせたニューロン培養（VGLUT1-KO/2-KD）を作成した。このグルタミン酸の小胞内への取り込みを完全に消失させたニューロンを用いた検討において、グルタミン酸がシナプス小胞に濃縮される過程が、小胞リサイクリングにどのように関連するかを検討した。
小胞タンパク質であるsynaptophysinの小胞内領域にpH感受性蛍光タンパク質mOrange2 (pKa=6.1)を導入したプローブを用いて、小胞内プロトン動態を解析したところ、VGLUTの取り込みを阻害したニューロンでは、エンドサイトーシス後の小胞の再酸性化過程が顕著に遅延することが明らかとなった。現在、この機序を解明するために、小胞内に充填されたグルタミン酸がプロトンをバッファーすることで、再酸性化を促進する可能性を考え、実験を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の研究計画であった、エンドサイトーシス時にVGLUTタンパク質の小胞への回収を遅延させる変異体の機能解析に関して、変異型VGLUT1のレンチウイルスの感染効率が悪く、オータプスニューロンでの効率的な実験ができなかったため、プロモーター部分の再検討を行ったため遅れているが、小胞内プロトン動態を解析が計画よりも進んでいるため、全体的な研究計画としては順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

エンドサイトーシス時にVGLUTタンパク質の小胞への回収を遅延させる変異体の機能解析を行う。VGLUTのC末端に存在する、エンドサイトーシス時にクラスリン被膜との橋渡しをするアダプタータンパクであるAP-2に結合する部位であるDi-leucineモチーフに変異を加えたVGLUT1-FV/AAのシナプス放出特性の解析を行うことで、シナプス小胞の再利用工程がシナプス伝達に及ぼす影響を解明する。また、グルタミン酸作動性ニューロンでの、シナプス伝達における小胞内プロトン動態を解析することで、グルタミン酸再充填過程におけるプロトンの役割について結論が得られることを期待している。