2022 Fiscal Year Research-status Report
Development of MRI probes with signal amplification mechanism to elucidate zinc metabolism and dynamics
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22K06570
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| Research Institution | Kobe Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
奥田 健介 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (00311796)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高木 晃 神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (00758980)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 亜鉛 / プローブ / シグナル増幅 / MRI / 代謝 / 動態 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、遊離亜鉛がシグナル伝達経路のメディエーターとして機能することが提唱されており、亜鉛ホメオスタシスの崩壊とアルツハイマー病、糖尿病、がんなどの多様な疾患との関連性も明らかとなってきている。これらの研究とも相まって、蛍光法に代表される光イメージングによる遊離亜鉛を可視化するイメージングプローブが多数開発されてきた。しかし光では組織透過性に限界があるため、非侵襲的な亜鉛のin vivoイメージング技術が遊離亜鉛のホメオスタシスと病態との関連性の更なる解明のために望まれている。
この観点から、すぐれた生体透過性を備えたモダリティとして知られる磁気共鳴イメージング（MRI）に着目した。実際これまでにも多数の亜鉛検出MRIプローブが開発されてきてはいるが、MRIの感度は蛍光プローブと比較して数桁も劣るため、高濃度亜鉛の検出に限られているのが現状である。そこで、MRIの感度を向上させる設計をプローブデザインに導入することにより、従来の亜鉛MRIプローブでは観察することが不可能な低濃度の遊離亜鉛を非侵襲的に観測することが可能となる。
まず、生体内での高い特異性を利用するべく、MRIシグナル原子としてフッ素（19F）を利用することとした。また、感度を向上させるシグナル増幅機構としては、私たちが高感度亜鉛蛍光プローブの開発の際に活用した亜鉛選択的なβ-ラクタム環の加水分解反応を活用した。この反応は、蛍光プローブにおいては消光されていた蛍光団が亜鉛選択的な開裂反応に伴って発蛍光反応を生じる。その一方、MRIプローブに適用するにあたっては、開裂反応に伴って19Fの核磁気共鳴信号が大幅に変化するようにプローブ構造を設計する必要がある。本年度においては、第一世代の亜鉛MRIプローブの設計・合成を行い、19F-NMRによる評価を行ったところ、本プローブによって19F-MRIでの亜鉛の検出が可能であることが強く示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
まず、先行研究である高感度亜鉛蛍光プローブでの設計を活用して19F-MRIプローブの設計・合成を行った。すなわち、ACLE（7-amino-3-chloromethyl-3-cephem-4-carboxylic acid p-methoxybenzyl ester）塩酸塩を出発原料として用い、1) アミノ基のBoc化、2) 3位クロロメチル基の2,6-ジフルオロフェノキシメチル基への変換、3) スルフィドのスルホキシドへの酸化、4) TFAによるBoc基およびPMB基の除去、5) 別途調製したbis(pyridin-2-ylmethyl)glycineとの縮合、を順次行うことにより、所望の第一世代亜鉛MRIプローブDpa-SoxLdiFを得た。同様の手法により、3位クロロメチル基を2-トリフルオロメチルフェノキシメチル基へと変換したDpa-SoxLtriFをも得た。分子内に等価な19F原子をDpa-SoxLdiFは2個、Dpa-SoxLtriFは3個有していることから、Dpa-SoxLtriFでは19F-MRIシグナルの感度の向上を期待した。
次いで、19F-NMRを用いてDpa-SoxLdiFならびに亜鉛との反応後に放出することが期待される2,6-ジフルオロフェノールの測定を行った。その結果、プローブであるDpa-SoxLdiFと2,6-ジフルオロフェノールとの19F-NMRでの化学シフトの差はMRIで十分区別して検出できる程度に異なっていた。続いて、Dpa-SoxLdiFを用いて亜鉛添加による2,6-ジフルオロフェノールの放出を19F-NMRの化学シフトの変化により観測したところ、触媒量の亜鉛添加においても完全に放出されていた。この結果より、期待通りに亜鉛が触媒回転してシグナルを増幅していることが明らかとなった。さらに、細胞内環境を模倣した還元的環境においても多少の阻害はみられるものの、亜鉛によるDpa-SoxLdiFからの2,6-ジフルオロフェノールの放出は進行し、細胞内遊離亜鉛のMRI検出にむけて期待が持てる結果も得られた。その一方で、当初今年度に計画していた亜鉛認識部位である2,2’-ジピコリルアミン（Dpa）部位の構造最適化には至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
亜鉛選択性を評価するべく、亜鉛以外の生体内に存在する二価金属イオンとのDpa-SoxLdiFの反応性を19F-NMRを用いて測定する。並行して亜鉛の検出限界、速度論的なパラメータも求める。プローブとしての性能の向上を図るべく、亜鉛認識部位であるDpa部位の変換を行うことによって、亜鉛への親和性を調節するとともに亜鉛錯体上の配位水の求核性を向上させて2,6-ジフルオロフェノールの放出を加速させる設計を施す。脱離能の変化によるプローブの応答速度の向上を目指して脱離基部位のエーテルからチオエーテルへの変換も試みる。なお、以上の検討によって最適化したプローブは4位カルボキシ基に由来する水溶性のために細胞膜透過性をもたないことが予想される。そこで、このカルボキシ基を変換して細胞膜透過性を付与した上で細胞内遊離亜鉛のMRイメージングを目指す。
その一方、プローブ分子内の等価な19F原子数を増加させることによるMRIでの感度の向上を目指して合成したDpa-SoxLtriFではプローブと期待される生成物である2-トリフルオロメチルフェノールとの19F-NMRでの化学シフトの差は小さく、MRIで区別して検出するには厳しいことが予想された。そこで常磁性緩和促進効果を活用して19F-MRIシグナルが亜鉛との反応によりoffからonへと変化するように、Dpa-SoxLtriFにガドリニウム錯体を導入することも試みる。
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| Causes of Carryover |
1,115,315円と次年度に繰り越し金が生じた状況としては、本年度に当科学研究費補助金で支出を予定していた少額機器類や試薬などの消耗品費を他の経費で賄うことができたために、次年度使用額が生じた次第である。計画変更に伴って試薬や機器の購入時期を変更しており、次年度以降に試薬など消耗品の購入を一括して行うことで安価に試薬類を購入できると考えている。
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