2023 Fiscal Year Research-status Report
Rho活性化因子に対するタンパク質相互作用原理を用いた新規機能調節分子の創成
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22K06579
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
上田 浩 岐阜大学, 工学部, 教授 (50253779)
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2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | RhoGEF / NCK2 / SH3ドメイン / PH ドメイン / PxxPモチーフ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までに、RhoGEFの一種であるPLEKHG1のPHドメイン上に、PXXPモチーフが存在し、そのモチーフにアダプタータンパク質の一種である NCK2が結合することにより、 PLEKHG1のRhoGEF活性が抑制されることを見出したことから、他の70種類存在するRhoGEFのPHドメインにPXXPモチーフを持つものが存在するかどうかを確認し、5種類のRhoGEFのPHドメイン上にPXXPモチーフが存在することを明らかにした。さらに、そのうちの4つについては、 PLEKHG1とほぼ同様の位置(PHドメインの開始アミノ酸から数えた場合)にPXXPモチーフが存在することも明らかした。さらに、それぞれのRhoGEFの活性に対するNCK2の影響を確かめた結果、予想通り、PLEKHG1を含む5つのRhoGEFにおいて、NCK2と の共発現により、SRF活性が抑制された。このことから、予想通り、NCK2によりPHドメインにPXXPモチーフを持つRhoGEFはその活性が抑制されることが示唆された。さらに、免疫沈降実験から、これらのRhoGEF及びNCK2それぞれの各種変異体を用いた実験から、RhoGEFとNCK2は、このPHドメイン上のPXXPモチーフを介して相互作用していることも明らかにした。今年度は、計画通り、これらのRhoGEFの全長およびDH-PHドメイン変異体等の細胞局在が、NCK2との共発現により、どのような影響が与えられるかについて検討を行った。その結果、SRF活性抑制の結果を反映し、RhoGEFによるアクチン再構築を示した細胞形態が、NCK2との共発現により、抑制されることが明らかにできた。現在、さらに必要なアミノ酸配列を絞り込むため、各種変異体を調製中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年の報告書および計画に記載している通り、それぞれのRhoGEFとNCK2との共発現細胞における各種変異体の細胞形態変化への影響等について細胞イメージン グ技術を用いて取得し、PHドメインとSH3ドメインの相互作用について、細胞形態からも補強することができたと考え、概ね順調に計画は進んでいると考えた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、計画に従い、必要なアミノ酸配列を絞り込み、そのアミノ酸配列を含むペプチド断片で相互作用等が阻害できるかや、細胞形態変化の抑制ができるかなどを検討する。さらに、生理的に、この相互作用が関与する現象について、検索し、その生理現象に対しての効果、あるいはその生理現象に関わる疾患モデルについて、検討を進めるつもりでいる。また、さらに、RhoGEFのSH3ドメインを含む他のタンパク質との相互作用についても、検討する必要があると考えている。
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| Causes of Carryover |
研究計画で見込んでいた抗体使用量が、実験の進捗状況が思っていた以上にうまく進み、使用量が少なくすみ、それに伴う抗体購入額が少なくて済んだこと、また、現在のドル円相場の急激な変動のため、次年度以降で必要となるペプチド合成などに当初考えていた以上に予算が必要となる可能性や、別の観点からノックアウト細胞の調製なども必要な可能性が出てきたことなどから、実験に必要な消耗品の値段高騰に合わせこれらの実験に次年度使用したいと考え、次年度使用額が生じた。
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