2022 Fiscal Year Research-status Report
糸状菌の細胞表層動態を可視化する～新しい薬剤標的スクリーニング系の開発に向けて～
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22K06600
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| Research Institution | Tohoku Medical and Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
田中 大 東北医科薬科大学, 薬学部, 助教 (00613449)
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2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 細胞壁多糖 / Aspergillus fumigatus / プロテインノックダウン / オーキシンデグロン / ガラクトフラノース |
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和４年度は、オーキシンデグロンシステムを利用したプロテインノックダウン実験系をAspergillus fumigatus に実装するための、技術基盤整備に着手した。特に、オーキシンデグロンの主要構成要素である OsTIR1 遺伝子を Aspergillus 属の恒常発現プロモーター PkpiA や誘導発現プロモーター PglaAの下流で制御するように発現ベクターを組換えつつ、OsTIR1 タンパク質をコードする塩基配列のコドン最適化を検討 することで、Aspergillus 属真菌における TIR1 タンパク質発現レベルの改善に成功した。
同時並行で、本菌のプロテインノックダウンのよりよい遺伝子標的を探す目的で、細胞壁ガラクトマンナン生合成にかかわる遺伝子を探していたところ、それぞれ独立にガラクトマンナン生合成を担う Mnt1、AnpAを同定し、査読付き英語論文誌にて報告した (Kadooka et al., Glycobiology, 2023; Kadooka et al., mSphere, 2023)。Mnt1は糖タンパク質型ガラクトマンナン、AnpAは糸状菌型コアマンナンの生合成に寄与していた。anpA遺伝子欠損株では、既知の cmsA 遺伝子欠損株と同じレベルでコアマンナン構造が高度に破壊されるが、cmsA遺伝子欠損株で見られるような 高度の菌糸生育異常は観察されない。このことは、コアマンナン構造の破壊と糸状菌型生育が必ずしも相関しないことを示唆する。プロテインノックダウンの標的としてAnpAを試してみることで、コアマンナン構造と菌糸型生育の相関関係をより深く理解することができるだろう。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和４年度は、オーキシンデグロンシステムを Aspergillus fumigatus に実装するための技術基盤の整備に着手した。OsTIR1 遺伝子のコドン最適化、ならびに発現プロモーターの組換えにより発現量を改善することができたが、これは概ね想定通りの進捗である。また当初の計画通り、細胞壁ベータ1-3グルカン合成酵素遺伝子 fks1をプロテインノックダウン標的とする遺伝子組換え株を作出できた。また、細胞壁ガラクトフラナン糖鎖生合成に寄与する glfA 遺伝子、細胞壁コアマンナン生合成に寄与する cmsA 遺伝子など、いくつかの標的でも遺伝子組換え株を作出した。研究を遂行するための実験の準備は概ね順調であり、次年度は標的遺伝子のプロテインノックダウンを実行し、表現型にどのように影響するか観察できると思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和４年度は、オーキシンデグロンシステムを Aspergillus fumigatus に実装するための技術基盤の整備に着手した。本菌における OsTIR1 タンパク質の発現を改善するため、オーキシンデグロンの主要構成要素である OsTIR1 遺伝子のコドン最適化、ならびに発現プロモーターの組換えを行うことで、 OsTIR1 タンパク質発現レベルの改善とプロテインノックダウン効率を上げることに成功した。次年度は、ガラクトマンナン生合成遺伝子のなかからプロテインノックダウン標的をいくつか選抜し、それらにプロテインノックダウンを誘導して、経時的に起こるだろう表現型変化を観察する。
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