2022 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of lipid domains around receptor tyrosine kinases by super-resolution microscopy
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22K06609
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
阿部 充宏 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (90415068)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | 受容体型チロシンキナーゼ / EGFR / 脂質ラフト / ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸 / 超解像顕微鏡 / 一分子イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
過去の生化学的な解析から、受容体型チロシンキナーゼは、脂質ラフトに局在することが示唆されていた。本研究では、「脂質プローブ」と「超解像顕微鏡法」とを組み合わせることにより、受容体型チロシンキナーゼが脂質ラフトに局在するか、受容体型チロシンキナーゼが脂質ラフト中の脂質によって活性制御されるか、を明らかにすることを目的とする。
本年度は、代表的な受容体型チロシンキナーゼであるEGFRが、どの脂質ドメインに存在するかを調べるために、EGFRと脂質プローブとの共局在解析を超解像顕微鏡によって行った。脂質プローブとして、SMに対してはEquinatoxin II、クラスター化したSMに対してはLysenin、SM/Chol複合体に対してはNakanori、Cholに対してはD4H、ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸 (PIP2) に対してはPLC delta-PH、ホスファチジルイノシトール3,4,5-トリスリン酸 (PIP3) に対してはGRP1-PH、ホスファチジルセリン (PS) に対してはevectin2-PHを用いた。超解像顕微鏡の共局在率はRipley’s bivariate K-functionで評価した。その結果、EGF刺激前には、EGFRはPIP2と高い頻度で共局在が観察された。ところが、EGF刺激後には共局在が低下することが分かった。一分子イメージング法でも検証した結果、同様の結果が得られた。この共局在の低下は、PLC gammaによって、EGFR周囲のPIP2が分解されるためであることが示唆された。
また、EGFR以外の受容体型チロシンキナーゼについて、ヒトのcDNAから50種類以上をクローニングし、次年度以降の超解像顕微鏡による解析のための準備を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
どうしてもクローニングできないものもあったが、9割程度の受容体型チロシンキナーゼがクローニングされた。得られたものについてのみ、解析を進める。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度、EGF刺激前には、EGFRはPIP2と高い頻度で共局在が観察された。次年度は、この共局在の意義を調べる。具体的には、PIP2に対するホスファターゼを細胞内で発現することによって、PIP2の量を低下させた場合のEGFRの活性を測定する。細胞全体だけではなく、光遺伝学的手法による局所的な脂質の分解も行う。EGFR活性は、抗リン酸化抗体によるwestern blottingにより行う。また、顕微鏡下でそれぞれの脂質の減少をモニターしながら、抗リン酸化抗体を用いて顕微鏡下で測定する。結果を検証するため、EGFRが活性化されたときにEGFRと結合する下流因子 (Grb2、 PLC gamma) について、超解像顕微鏡で共局在解析を行う。一連の実験データを考察し、なぜEGFRはEGF刺激前にPIP2ドメインに局在するか、なぜEGF刺激後には局在しなくなるか、の生理的意義について明らかにしたい。
また、本年度クローニングしたEGFR以外の受容体型チロシンキナーゼについても、脂質ドメインとの共局在を超解像顕微鏡により調べる。
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| Causes of Carryover |
ほぼ予算を使用し、1000円未満が残った。無駄な使用をせず、次年度に繰り越し、有効に使用する。
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