2023 Fiscal Year Research-status Report

蛍光アセチルコリンセンサーによる細胞内コリン伝達系の実証

Research Project

Project/Area Number	22K06637
Research Institution	Kanazawa Medical University
Principal Investigator	宇和田淳介金沢医科大学, 医学部, 講師 (70580314)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	村松郁延金沢医科大学, 医学部, 客員教授 (10111965) 中澤瞳金沢医科大学, 医学部, 研究員 (20712300) [Withdrawn] 益岡尚由金沢医科大学, 医学部, 教授 (80509307)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	ムスカリン受容体 / GPCR / トランスポーター / アセチルコリンセンサー / 循環置換GFP / Gタンパク質共役型受容体
Outline of Annual Research Achievements	これまでに研究代表者はアセチルコリンをリガンドとするムスカリンM1受容体が細胞の内部にも局在し、活性化されうることを明らかにしている。この研究では、細胞の内部でムスカリンＭ１受容体が活性化される様子を直接的に検出する系を確立し、そのメカニズムの全容に迫る目的で行われた。細胞内で活性化されることを検出するためにＭ１受容体に循環置換GFPを導入し、活性化に伴う蛍光の増加を観察するセンサーとした。昨年までに、細胞内に局在する受容体を活性化するために必要とされるアセチルコリンのトランスポーターの同定に成功している。今年度は、このトランスポーターのマウス脳組織における発現をin situ hybridizationで検出した。その結果、トランスポーターの発現は、大脳皮質および海馬のニューロンにおいてM1受容体と共発現することが明らかとなった。さらに、細胞レベルでの観察においても、M1受容体が細胞内で局在するトランスゴルジネットワーク（TGN）において、このトランスポーターも局在することが分かった。つまり、このトランスポーターは細胞内へアセチルコリンを輸送するとともに、TGN内部にもアセチルコリンを運び、内部からM1受容体を活性化するために機能すると考えられる。現在、このトランスポーターのTGN局在性の低下した変異体を作製してその仮説を検証しようという状況である。これらの研究に加えて、TGNへの膜タンパク質の逆行輸送を制御するPIKfyveというキナーゼのM1受容体やトランスポーターのTGN局在性への関わりを調べる過程で、PIKfyveとグルタミンおよびアンモニア代謝との関わりを示す結果を得た。当初の研究計画にはなかった研究対象ではあるが非常に興味深い知見であり、その解明にも研究資源の一部を割いた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ムスカリンM1受容体とともにアセチルコリントランスポーターが大脳皮質および海馬のニューロンで発現していることを明らかにしたことは、in vivoで実際に細胞内のM1受容体が細胞内へ取り込まれたアセチルコリンによって活性化される可能性を支持する成果であり、重要な進展である。このトランスポーターを遺伝子編集によりノックアウトしたマウスも作製を進め、実際にノックアウトされていることを確認しており、以降の研究に使用可能な状況となっている。研究の過程で偶発的に明らかとなったPIKfyveとグルタミンおよびアンモニア代謝との関係については、早急に研究成果としてまとめており、論文として雑誌へ投稿中である。
Strategy for Future Research Activity	アセチルコリントランスポーターのノックアウトマウスの作製を終えたため、そのマウスを使用して、in vitroおよびin vivoの系による細胞内M1受容体の活性化の有無を検証する研究を行う。In vitroおよびin vivoのニューロンで細胞内アセチルコリンセンサーを発現させるためのアデノ随伴ウイルスの作製は既に完了している。さらに、トランポーターのTGN局在に関する分子生物学的解析を通して、メカニズムの裏付けを得たうえで、論文としてのまとめ上げに進む予定である。
Causes of Carryover	作製したノックアウトマウスの費用を確保するために本年の使用を一部控えたために次年度使用額が生じることとなった。次年度はその費用を支払ったうえで当該マウスを用いた解析を進める予定である。