2022 Fiscal Year Research-status Report
Development of a rational screening method for highly efficient search for neurotrophic compounds
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22K06689
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| Research Institution | Tokushima Bunri University |
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Principal Investigator |
久保 美和 徳島文理大学, 薬学部, 教授 (00330754)
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2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 神経栄養因子 / ブラインシュリンプアッセイ / メタボロミクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
BSTと PC12 細胞に対する活性にどの程度の相関性があるのか再検討した。77種類ミャンマー産植物ライブラリーのうち、BSTに活性を示したのは20サンプル、活性がなかったものは57サンプルであった。活性を示した20サンプルのうち、16サンプルがPC12細胞にて活性が認められた。すなわち、BSTでピックアップできたサンプルの80％がPC12細胞に活性を示したことになる。一方、BSTに活性のなかった57サンプルのうち40サンプルでPC12細胞に活性が認められなかった。つまり、BST活性のなかったサンプルの約70%がPC12細胞に対して活性を示さないことがわかった。
ブラインシュリンプの動きを追跡できるトラッキングシステムを構築し，その動きを数値化したハイスループットBST の確立を目指した。ブラインシュリンプはかなり小さいため，一般的な動画撮影用カメラでの撮影は難しい。様々なカメラのデモを試みたところ，ハイスピードカメラが最も良いことがわかった。シュリンプが入ったシャーレの真上にカメラを設置し，コントロール，ポジティブコントロールとしてBST活性を有することが分かっているバングレンを添加し，撮影，トラッキング解析を行った。コントロールとポジティブコントロールで明らかにシュリンプの動きに差が認められ，数値として表すことができた。ただし，シャーレ側面の影にシュリンプが入り込み，解析作業を複雑にすること，シュリンプの餌として加えているクロレラ等がシュリンプと誤認識されることがわかった。迅速な解析作業でなければHTSとして意味をなさないため，細かい微調整が必要となった。餌のタイミング，シャーレの種類，人工海水の容量など様々な検討を行った。その結果，シャーレを高輝度バックライト照明上に置き，真上から撮影することで解決することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ブラインシュリンプの動きを追跡できるトラッキングシステムの構築に必要なカメラの選定に難航したため。改良型 BST よる予備実験から，ブラインシュリンプの動きと PC12 細胞に対する活性に，ある程度の相関性があることを見いだしている。特に，痙攣様の動きが非常に重要であることが分かっているが，ブラインシュリンプの動きをトラッキング解析するためには，正確に動きを記録するカメラが必要である。カメラのデモ等を繰り返し実施し，少し時間はかかったが，最適なカメラ，解析システムを見積もることができた。来年度は本システムを設置し，研究計画を進めていきたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
ブラインシュリンプの動きを追跡できるトラッキングシステムを構築し，その動きを数値化したハイスループットBST (HT-BST) を確立する。申請者は改良型 BST よる予備実験から，ブラインシュリンプの動きと PC12 細胞に対する活性に，ある程度の相関性があることを見いだしている。特に，痙攣様の動きが非常に重要であることが分かっているが，動きを目視で観察している本方法では，観察する実験者により評価が一定しない可能性があることが問題点であった。そこで，ブラインシュリンプの動きをトラッキング解析できるシステムへの改良を検討する。トラッキングして得られたBST結果を数値化し，スコアー1 (S1) として算出する。既に確立している PC12 細胞を用いたスクリーニング法を改良し，蛍光免疫染色法により神経突起伸展促進活性を蛍光量で定量化できるハイスループットNeurite outgrowth screening (HT-NOS)を確立する。マイクロプレートリーダーで測定した蛍光量をスコアー2 (S2)として算出する。改良には既に着手し，細胞密度，抗体免疫染色時のインキュベート時間などの検討課題を残しているものの，改良法確立の目処は立っている。
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| Causes of Carryover |
初年度に確立予定であったハイスループット型ブラインシュリンプテストの構築ができなかったため，研究をあまり進めることができなかった。トラッキングシステムに必要なカメラ，照明等の選定はできたため，次年度から本格的にハイスループット型ブラインシュリンプテストの構築を進める計画である。
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