2022 Fiscal Year Research-status Report
Drug discovery through identification of microbial products against SARS-CoV-2 proteases
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22K06692
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| Research Institution | Microbial Chemistry Research Foundation |
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Principal Investigator |
山崎 学 公益財団法人微生物化学研究会, 微生物化学研究所, 研究員 (50442570)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | SARS-CoV-2 / 天然物創薬 / メインプロテアーゼ / パパイン様プロテアーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
次世代のCOVID-19治療薬のバックアップを整備することは、薬剤耐性化や新たなコロナウイルスの出現に迅速に対応する上で重要である。本研究では、リード化合物創製の起点となる母核構造の提案を目指して、医薬品開発にインスピレーションを与えた天然物化合物に着目する。そこで、微生物培養液をソースとして、原因ウイルスのSARS-CoV-2に必須の２種のプロテアーゼを阻害する化合物を同定・最適化することを目的とする。初年度は当初の計画に沿って、（１）メインプロテアーゼ（Mpro）を阻害するヒット培養液中の活性成分の精製、（２）パパイン様プロテアーゼ（PLpro）のスクリーニング、および（３）各プロテアーゼの培養細胞評価系の構築を実施した。
（１）研究開始時、培養液8,280サンプルのスクリーニングからMproを阻害する18サンプルを得ており、これらをC18逆相カラムにて分取した。活性分画について還元剤の影響やカテプシンBに対する選択性を評価し、有望なプロファイルを示す複数の培養液を見出した。
（２）PLproについては培養液2,880サンプルをスクリーニングし、134サンプルのヒットを得た。次にパパインを用いたカウンターアッセイにより、選択性を示す19サンプルを見出した。
（３）同定した（または精製途中の）活性成分の細胞での作用を評価するために、Mpro（またはPLpro）とスプリットNanoLuc（切断配列を挟み込んだルシフェラーゼレポーター）を共発現するプラスミドを構築した。Mpro発現プラスミドを293T細胞に導入した結果、NanoLucの切断による発光の低下を認めた。活性中心変異体では発光が維持したことから、Mpro特異的な切断が示された。一方、PLpro発現プラスミドでは、活性中心変異体でも複数の細胞株でNanoLucの切断が起こり、宿主プロテアーゼによる作用が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Mproを阻害するヒット培養液については、活性成分の予備的な精製と阻害活性のプロファイルを評価し、引き続き精製・構造決定を進める有望なサンプルの選抜を完了した。ただし質の高いNMR分析を満たす純度・濃度には至っておらず、精製条件の種々検討を進めている。
PLproについてはスクリーニングを完了し、活性成分の精製を検討するヒット培養液を得た。現在、Mproの場合と同様にして精製・構造決定を進めるサンプルの選抜を進めている。
Mpro酵素活性の培養細胞評価系は計画通り順調に構築できた。PLproの評価系については、最小機能ドメイン（318アミノ酸）と外側を含む領域（1151アミノ酸：厳密な基質認識に必要なことが示唆されている）の２種のプラスミドを計画した。このとき後者は大腸菌内で不安定（変異しやすい）かつPCR増幅しにくい問題が生じた。さらに活性中心変異体でもスプリットNanoLucが切断されたことから、複数の切断配列（ポリプロテイン上の３ヶ所またはISG15切断配列）の検討を加えた。このために本年度の計画に想定外の遅延が生じた。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の研究計画に大きな変化は無く、本年に選抜したヒット培養液について、活性成分の精製・構造決定に注力する。精製過程では選択性や培養細胞での阻害効果を適宜評価し、構造決定を優先する有望なサンプルの取捨選択を進め、研究進展の効率化を図る。化合物を同定した後、母核構造のユニークさや物理化学的特性、阻害効果のプロファイルを踏まえてシード化合物を選抜し、結晶構造解析や誘導体展開に着手する。またレプリコン細胞や野生型ウイルス感染細胞での複製阻害効果を検証する。
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| Causes of Carryover |
上述の通り時間を要するトラブルシュートが生じたため、実験計画を一部変更して対応し、結果的に購入予定の高額試薬の本年度の使用量が減少した。一方、次年度は活性成分の精製過程で当該試薬の使用量が増える見込みなために、次年度使用額が生じた。
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