2022 Fiscal Year Research-status Report
Study of the effect of the cancer vaccine using SV40 VLP that induces adaptive immune responses
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22K06731
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
川野 雅章 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (30447528)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | Simian virus 40 / VP1 / Virus-like particle / 獲得免疫 / 抗体産生 / 細胞傷害性T細胞 / CD86 / CCL3/CCL4 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
サルのポリオーマウイルスであるSimian virus 40 (SV40) は、VP1タンパク質のみで直径50 nmの正二十面体構造のウイルス粒子を形成することができる。5つのVP1はVP1五量体と呼ばれるドーナツ状のサブユニットを形成した後、72個のVP1五量体が宿主因子を必要とせずに自己集合化することでウイルス粒子を形成する。我々はこれまでに、組換え体としてSV40 VP1を昆虫細胞で大量発現させることで中身が中空のウイルス様粒子 (Virus-like particle, VLP) を形成させて、このVLPを高度に精製する技術を構築した。また、このVLPの内部に外来の抗原タンパク質を内包する技術も構築した。さらに、この外来抗原を内包したVLPをマウスに投与すると、免疫賦活剤（アジュバント）を加えること無く、内包した外来抗原に対して、水酸化アルミニウムアジュバントと共に抗原を免疫した場合と同等の抗体産生を誘導し、また、CpGアジュバントと共に抗原を免疫した場合以上の細胞傷害性T細胞を誘導することを明らかにした。その一方で、SV40 VLPは、他のアジュバントとは異なり、リンパ球と混合しても、炎症性サイトカインであるIFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-1βの産生を誘導せず、従ってマウスに外来抗原内包VLPを導入した部位に炎症を誘導することは無かった。このSV40 VLPに特有の獲得免疫誘導機構の分子メカニズムを解析する中で、SV40 VLPはB細胞に対して、強力にCD86の発現を誘導し、CCL3/4の分泌を誘導することを発見した。さらに、このSV40 VLPに特異的なCD86の発現は、恒常的なCD86のユビキチン化による分解誘導を阻害することで誘導されている可能性を示した。この発現誘導はシャペロンタンパク質阻害剤や細胞増殖阻害剤でも抑制されることを示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究計画年度においては、サルのポリオーマウイルスであるSimian virus 40 (SV40) のVP1タンパク質のみで構成されたウイルス様粒子 (Virus-like particle, VLP) がマウスリンパ球に作用するとCD86分子の発現を強力に上昇させる免疫機構、および、CCL3/4の分泌を強力に誘導する機構の分子メカニズムを解析することを目的とした。CD86分子は、免疫細胞が獲得免疫を誘導するにあたり、抗原提示細胞であるマクロファージや樹状細胞が、外来のウイルスや細菌などの抗原を取り込み、それらのタンパク質をペプチドに分解して、MHC class I/II分子で分解した抗原由来ペプチドを提示する。この抗原由来ペプチド-MHC class I/II複合体を未熟細胞傷害性T細胞 (MHC class Iを認識) および未熟ヘルパーT細胞 (MHC class IIを認識) 各々のT細胞受容体が認識することでエフェクターT細胞となるが、その際、CD86は補助刺激因子として重要な働きをする。また、CCL3/4は遊走因子として抗原提示細胞がT細胞を引き寄せるために重要な因子であると考えられている。そのために、まず、SV40 VLP特異的なCD86の発現上昇とCCL3/4の分泌を誘導する免疫細胞の探索を行い、B細胞が最も強力にこれらの誘導を行うことを明らかにした。さらに、B細胞におけるSV40 VLP特異的なCD86分子の発現上昇が、CD86分子の脱ユビキチン化誘導経路で制御されており、特定のシャペロンタンパク質阻害剤や細胞増殖阻害剤がこの脱ユビキチン化誘導経路を遮断し、CD86分子の発現上昇を抑制する可能性が示唆された。そのため、本研究計画年度の目的であったCD86分子の発現を強力に上昇させる免疫機構の分子メカニズムの解析はおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の推進方策としては、本研究計画年度に引き続き、CD86分子の発現を上昇させる免疫機構の分子メカニズムをさらに詳細に解析することを目的とする。これまでのところ、樹状細胞などの抗原提示細胞におけるCD86の恒常的なユビキチン化が、E3ユビキチンリガーゼであるMARCH1により行われており、常にCD86の分解が誘導されていることが示唆されている。この恒常的なユビキチン化が抑制されると、CD86の発現が安定化し、細胞表面にCD86が発現する。細菌およびウイルスに特有の成分がToll-like receptorなどのパターン認識分子により免疫活性化された際に発現誘導されるCD83分子に存在する膜貫通領域はMARCH1と相互作用することで、CD86とMARCH1との相互作用を奪い、その結果CD86の恒常的なユビキチン化が抑制されることが示唆されている。この分子メカニズムがB細胞におけるSV40 VLPに特異的なCD86の発現上昇にも関与していることを解析するために、まず、抗CD83抗体を用いたフローサイトメトリーを用いてB細胞においてSV40 VLPに特異的なCD83の発現上昇が誘導されていることを解析する。さらに、CD83の発現上昇には、IRF1, IRF2, IRF5, p50, p65, cRelなどの転写因子の関与が示唆されているので、これらの転写因子の上流のシグナル伝達に対する阻害剤やノックダウン法を駆使して、B細胞のCD83の発現を抑制させた状態では、SV40 VLP特異的なCD86の発現上昇が抑制されることを解析する。さらに、抗CD86抗体を用いたフローサイトメトリーにより、マウスB細胞系リンパ腫細胞株であるA20を用いて、ユビキチン化抑制剤によりCD86の発現上昇が誘導されること、および、CD83の強制発現によりCD86の発現上昇が誘導されることを解析する。
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| Causes of Carryover |
本研究計画年度において、Simian virus 40 (SV40) のVP1タンパク質のみで構成されたウイルス様粒子 (Virus-like particle, VLP) がマウスリンパ球に作用した場合に、CD86分子の発現を強力に上昇させる免疫機構、および、CCL3/4の分泌を強力に誘導する機構の分子メカニズムを解析することを目的とした。この解析のために、マウスリンパ球に含まれる各免疫細胞の単離のために、磁気活性化細胞選別 (Magnetic-activated cell sorting, MACS) を用いたが、SV40 VLPに特異的なCD86分子の発現を上昇させる免疫細胞、および、CCL3/4の分泌を誘導する免疫細胞がB細胞であることを想定よりも速く見出すことに成功し、その結果、フローサイトメトリー解析に用いる予定の蛍光抗体、および、各種阻害剤の購入量を軽減することができた。本研究計画年度に軽減することができた試薬購入費用は、次年度に予定している、CD86分子の発現を上昇させる免疫機構の分子メカニズムのさらに詳細な分子メカニズム解析のために必要な、B細胞を単離するためのMACSビーズ、マウスCD83遺伝子発現プラスミドの構築費用、CD83やCD86の発現をフローサイトメトリーで解析するための各種蛍光抗体、および、CD83発現阻害剤などの試薬購入費用に充当する予定である。
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[Journal Article] Ropinirole inhibits inflammatory cytokine production in gingival epithelial cells and suppresses alveolar bone loss in an experimental rat model of periodontitis.2023
Author(s)
Isozaki, Y., Sato, T., Takagi, R., Ito, K., Usui, M., Kawano, M., Matsushita, S.
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Journal Title
Experimental and Therapeutic Medicine
Volume: 25
Pages: 1-7
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Signaling via dopamine and adenosine receptors modulate viral peptide-specific and T-cell IL-8 response in COVID-19.2022
Author(s)
Tokano,M., Takagi, R., Kawano, M., Maesaki, S., Tarumoto, N., Matsushita, S.
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Journal Title
Immunological Medicine
Volume: 45
Pages: 162-167
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Extracellular adenosine induces hypersecretion of IL-17A by T-helper 17 cells through the adenosine A2a receptor.2022
Author(s)
Tokano,M., Matsushita, S., Takagi, R., Yamamoto, T., Kawano, M.
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Journal Title
Brain, Behavior, & Immunity - Health
Volume: 26
Pages: 1-13
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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