2023 Fiscal Year Research-status Report
Direct reprogramming of somatic cells by epithelial-mesenchymal transition
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22K06808
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
本橋 力 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 講師 (40334932)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | ダイレクトリプログラミング / 上皮-間葉系転換 / EMT / 乳腺上皮細胞 / エピジェネティクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和５年度においては、以下の2つの研究を行った。
研究1 EMT現象によるゲノムのエピジェネティック状態変化の解析： EMTによりゲノムにエピジェネティック変化が起こり、転写の活性が高いクロマチン状態に変化するのではないかと考え、乳腺上皮細胞NMuMGを用いてその検証を行っている。令和５年度は、Histone H3のMethylationやAcetylationのEMT前後での変化の解析を行った。これまでの検討で、EMT前後でHistone H3の9番目のLys（H3K9）のTri-MethylationとHeterochromatin associated proteins 1γ(HP1γ)の発現が減じている様子は見られなかったため、H3K9以外のMethylationやAcetylationの探索と、解析の条件検討を行った。これらの指標のEMT前後での比較解析は今後行う予定である。
研究2 EMT現象を利用したダイレクトリプログラミング法の検討：これまでEMTが細胞にダイレクトリプログラミングされやすい環境を提供している可能性について検討してきた。本年度は、心筋細胞へのダイレクトリプログラミングを通してこの検証を行った。NMuMG細胞にEMTを起こし、続いて心筋細胞発生に関係する転写因子をレトロウィルスで発現させて転換を試みたが、心筋に転換した明確な証拠は得ることはできなかった。転写因子発現後の培養環境が十分ではないことが考えられ、この培養条件の検討を今後行う。
一方、ケラチノサイトのメラノサイトへの直接転換を利用して、同様の検討も行った。ケラチノサイトにEMTを発生させ、さらにメラノサイト発生に関係する転写因子を発現させると、メラノサイトへの転換効率が上昇する傾向が見られ、EMTが細胞にダイレクトリプログラミングされやすい環境を提供していることを支持する結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
EMTによるクロマチン状態変化の解析で、当初に予想した結果が得られず、ターゲットとするクロマチン部位を変更したため、その解析方法の検討、観察条件の設定に時間がかかっている。EMT現象を利用した心筋細胞へのダイレクトリプログラミング法では、遺伝子導入後の転換した細胞の培養法の検討が必要になった。一方、ケラチノサイトのメラノサイト直接転換を利用した検証も行い、EMT発生により転換効率の上昇が見られ、予想した結果を得ることができている。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度まで検討を行ってきたHiston H3のEMT前後でのMethylationやAcethylationの比較解析に実際に着手し、EMTにより転写の活性が高いクロマチン状態に至っている証拠を探し出す。
また、EMT現象を利用した心筋細胞へのダイレクトリプログラミング法の応用検討では、心筋転換の際の培養条件の検討を行うとともに、心筋転換の評価法の検討も行う。いままでRT-PCRによる発現遺伝子の解析と免疫染色により心筋転換を評価してきたが、心筋に発現する遺伝子を利用したレポーターシステムを構築し、この安定発現細胞の作成により心筋細胞転換評価を簡略化する。
さらに、昨年度に引き続きメラノサイトへのダイレクトリプログラミング法を利用した検討も行い、EMT現象が細胞にダイレクトリプログラミングされやすい環境を提供していることをサポートするデータを取得する。
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| Causes of Carryover |
実験計画の遅延により、令和５年度の経費を次年度に使用する必要が生じた。経費は繰越分を合わせて以下に示す項目に充てる予定である。
エピジェネティック解析のための各種抗体・試薬、フローサイトメーター解析のための各種蛍光抗体、遺伝子発現解析試薬、遺伝子発現制御システム・遺伝子導入関連物品（遺伝子導入試薬、電気的遺伝子導入機器、レトロウィルス発現関連試薬）、各種細胞培養のために必要な培養関連試薬、培地、実験用マウスなど動物飼育費用や受託解析等
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