ゼブラフィッシュ胚心臓における刺激伝導系細胞の可視化とその発生過程の発現情報収集

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K06815
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 山岸 敏之 埼玉医科大学, 保健医療学部, 教授 (60255122)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 甲斐 理武 大阪公立大学, 大学院医学研究科, 講師 (30572573)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 心臓 / 刺激伝導系 / ゼブラフィッシュ / HCN4

Outline of Annual Research Achievements

心臓の発生・分化における刺激伝導系の細胞系譜とその運命決定のメカニズムはいまだ不明である。ゼブラフィッシュは、遺伝子操作が容易であり、胚が透明であることから、生きたまま臓器の観察が容易に行える。これらは、細胞系譜の追跡や細胞レベルでの発現遺伝子の解析を空間的、また経時的に解析するのに適している。そこで本研究では、刺激伝導系細胞の成り立ちを分子の言葉で理解するため、ゼブラフィッシュを用いて心臓発生過程の遺伝子発現アトラスを作成し、その成り立ちを網羅的に解析することを試みている。魚類の刺激伝導系の存在は不明であったが、私たちはゼブラフィッシュの成魚心臓領域に刺激伝導系マーカー（HCN4）陽性細胞が存在することを見出した。これまでに、成体の心臓におけるHCN4抗体陽性細胞の局在を詳細に調べた。ゼブラフィッシュ心臓のHCN4陽性細胞は、心筋細胞に局在していることが明らかになった。今年度はこのHCN4抗体の特異性をさらに検討するため、ニワトリ胚の心臓におけるHCN4抗体陽性細胞の局在を明らかにすることを試みた。ニワトリ6日胚心臓でHCN4抗体陽性細胞を調べてみたところ、４％パラホルムアルデヒド固定の胚においては、心室，心房領域の心筋細胞，心内皮細胞の核に陽性反応が見られた。次に未固定凍結切片を試みたところ、HCN4抗体陽性細胞は、心室中隔の心筋細胞に陽性反応が見られた。今後、これらの陽性シグナルが刺激伝導系特異的なものかを明らかにする。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

マーカー抗体の条件検討、および機能評価に予想以上に時間がかかっている。そのため、HCN4遺伝子の分子レベルでの解析に十分な時間をとれていない。

Strategy for Future Research Activity

令和6年度は、既存の抗体陽性細胞の3次元構築を進めるとともに、遅れているHCN4遺伝子発現の分子レベルでの解析を進める。また刺激伝導系細胞の同定の精度を上げるため、新規刺激伝導系マーカーについて使用可能な抗体をスクリーニングし、刺激伝導系細胞のより詳細、かつ正確な局在の解析を試みる予定である。

Causes of Carryover

HCN4遺伝子の分子レベルの解析に関する研究が遅れており、その研究に対する費用が差額分として生じた。令和6年度はその研究に関して、DNA配列の単離とその遺伝子の発現領域の検討を行う事を予定しており、その研究費として使用する予定である。さらに当初予定していたように、HCN4陽性細胞の局在について3次元構築を試み、時間的・空間的な変化を明らかにするとともに、新規マーカーの探索も行う事を計画している。