2023 Fiscal Year Research-status Report

カルモジュリンに制御されるCav1.2チャネルの2つの不活性化機構

Research Project

Project/Area Number	22K06845
Research Institution	Kagoshima University
Principal Investigator	蓑部悦子鹿児島大学, 医歯学域医学系, 講師 (00448581)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	Cav1.2チャネル / カルモジュリン / 不活性化 / カルシウム / パッチクランプ法 / inside-out recording / pull-down assay
Outline of Annual Research Achievements	Cav1.2チャネルの不活性化は細胞内カルシウム濃度を生理的範囲内に留めることにおいて、重要な働きをしている。この不活性化に必須な因子として、カルシウムセンサー蛋白であるカルモジュリンがある。しかし、その調節機構の解明は十分ではない。これまでに、カルシウム濃度一定の条件下で、カルモジュリン濃度依存的にチャネルの活性が抑制されること、チャネルのアミノ末端に1分子、カルボキシル末端に2分子のカルモジュリンが結合することを報告し、2分子のカルモジュリンによるチャネル不活性化を想定した新規のモデルを提唱した。本研究では、昨年度に継続して、分子生物学的手法によりチャネルのC末端部にカルモジュリンを繋いだ変異体を用いて、カルシウム依存性の不活性化機構に含まれると考えられるカルモジュリン濃度依存性の不活性化について、結合実験と電気生理学実験によって解析を進めた。チャネル変異体のカルモジュリン結合部位のうち、アミノ末端1か所とカルボキシル末端５か所にアミノ酸変異を導入し、カルシウム濃度依存性の不活性化とカルモジュリン濃度依存性の不活性化に分けて観察した。また、チャネル変異体のカルボキシル末端ペプチドを大腸菌蛋白発現系を用いて単離精製し、結合実験を行った。その結果、カルモジュリンは低濃度カルシウム条件下で、IQドメインに結合しており、カルシウム濃度が上がると、2つ目のカルモジュリンがその上流に結合することが示唆された。チャネルの不活性化に関係するカルモジュリンの結合部位は、チャネルのアミノ末端とカルボキシル末端を含む複数の部位の相互作用により安定化することが示唆され、その特定には更なる検討が必要であると考える。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 実験結果の解析がおおむね進み、追加で必要な実験の目途が立った。
Strategy for Future Research Activity	新規に作成が必要と判断したチャネル変異体の作成を優先して行う。主に、電気生理学実験による解析において、不足しているデータを早急に取得し、論文にまとめる。
Causes of Carryover	研究成果の報告のために、雑誌投稿前の英文校閲などの諸経費に使用する予定であったが、追加実験を継続したため延期を余儀なくされ、その分の予算は次年度に使用する。