2022 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the gating mechanism of mechanosensitive channel by mechanical stimulation and amphipathic molecules
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22K06847
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
野村 健 兵庫県立大学, 環境人間学部, 准教授 (10706790)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
澤田 康之 名古屋大学, 未来社会創造機構, 准教授 (90718355)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 機械受容チャネル / MscL / メカノセンサー / 膜張力 / 分子動力学シミュレーション / タンパク質-脂質相互作用 / パッチクランプ / 大腸菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、野生型および突然変異型MscLを用い、MscLの活性化剤であり、両親媒性物質でもあるクロルプロマジン（CPZ）を細胞膜の内外葉に不均等に分布させた場合、それがどのように膜張力の増加に繋がり、2つのメカノセンサー（F7およびF78）の感度を高めチャネルを開口へと導くのか、その分子メカニズムを解明することを目的とする。具体的には、チャネルが開きにくい機能喪失型突然変異体（LOF: loss-of-function mutant）であるF7CおよびF78Hを用いて、細胞膜の内外葉および両葉側からCPZを投与した場合の機械刺激に対する応答をパッチクランプ法を用いて評価する。また、分子動力学シミュレーションを用いた解析結果と電気生理学的実験で得られた結果を比較・照合しMscLのゲーティング機構のモデル構築を目指す。
今年度は、F7CおよびF10Cの突然変異体を作成し、パッチクランプ法を用いて機械刺激感受性の評価を行った。しかし、両突然変異体において、チャネル電流を観察することができなかった。現在、他のアミノ酸に置換した突然変異体を作成中であり、今年度中にはin vivo（低浸透圧ショック実験）およびin vitro（パッチクランプ法）での評価を実施する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今回作成したF7CおよびF10C MscL突然変異体は、チャネルのゲート付近に位置しており、システイン残基同士でジスルフィド結合を形成している可能性が考えられるため、チャネル電流を観察することができなかった。新たにF7およびF10を他のアミノ酸に置換した突然変異体を作成する必要性が生じたことが研究の進捗を遅らせた一因と考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は今年度と同様に、F7またはF10 MscL突然変異体を作成し、in vivo（低浸透圧ショック実験）およびin vitro（パッチクランプ法）における機械刺激感受性の評価を行う。また、MscLチャネルの活性化剤であるクロルプロマジンを用いて、細胞膜の外葉に存在するF78および細胞膜の内葉に存在するF7、F10の機能的役割を検証する。
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| Causes of Carryover |
物品、消耗品の購入価格および出張予定が当初の計画と若干異なっていたために次年度使用額が生じたが、基本的には計画通りである。
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Research Products
(1 results)
