2024 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the gating mechanism of mechanosensitive channel by mechanical stimulation and amphipathic molecules
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22K06847
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
野村 健 兵庫県立大学, 環境人間学部, 准教授 (10706790)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
澤田 康之 名古屋大学, 未来社会創造機構, 准教授 (90718355)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | 機械受容チャネル / MscL / メカノセンサー / 膜張力 / タンパク質-脂質相互作用 / パッチクランプ / 大腸菌 / 分子動力学シミュレーション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、大腸菌に発現している機械受容チャネルMscL（mechanosensitive channel of large conductance）の野生型および突然変異型を用い、MscLの活性化剤である両親媒性物質クロルプロマジン（CPZ）を細胞膜の内外葉に不均等に分布させた場合、それがどのように膜張力の増加に繋がり、2つのメカノセンサー（F7およびF78）の感度を高めチャネルを開口へと導くのか、その分子メカニズムを解明することを目的とする。研究方法としては、チャネルが開きにくい機能喪失型突然変異体（LOF: loss-of-function mutant）であるF7XおよびF78Xを作成し、細胞膜の内葉、外葉および両葉側からCPZを投与した場合の機械刺激に対する応答をパッチクランプ法を用いて評価する。また、分子動力学シミュレーションを用いた解析結果と電気生理学的実験で得られた結果を比較・照合しMscLのゲーティング機構のモデル構築を目指す。今年度は、昨年度に引き続き、細胞膜の内葉側および外葉側に存在するF7とF78をそれぞれ19種類のアミノ酸残基に置換したMscL突然変異体をそれぞれ作成し、パッチクランプ法を用いて機械刺激感受性の評価（MscL/MscS）を行った。その結果、F7X MscL突然変異体は野生型MscL（1.65±0.11）に比べ高い閾値比（2.57±0.28）を示し、さらにF78X MscL突然変異体の閾値比（1.77±0.17）よりも活性化閾値が高く、F7Xの機械刺激感受性は、F78Xの1.53倍であることが分かった。これらの結果より、MscLの機械刺激感受性は、細胞膜の内葉と外葉で異なることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度は、F7およびF78を19種類のアミノ酸残基にそれぞれ置換した突然変異体の作成に時間を要したが、 パッチクランプ法を用いて各突然変異体の機械刺激感受性を評価することができた。一方、MscLのゲーティング機構の解明するためには、さらに多数の突然変異体の作成が必要であり、当初の予定より進行がやや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度は、F7XおよびF78X MscL突然変異体を用いた低浸透圧ショック実験、成長曲線の測定、およびウェスタンブロットに法を用いて細胞膜上での発現を確認する。また、MscL チャネルの活性化剤であるクロルプロマジンを用い、細胞膜の外葉に存在する F78 と内葉に存在する F7 の機能的役割を検証する。さらに、電気生理学的実験の結果と分子動力学シミュレーションによる解析結果を比較・照合し、MscL のゲーティング機構のモデル構築を目指す。
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| Causes of Carryover |
当初の予定よりも多数の突然変異体を作成する必要が生じたため、次年度使用額が発生した。次年度は、消耗品の購入や外部委託費等に使用する予定である。
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