2022 Fiscal Year Research-status Report
グリア細胞におけるPKM制御と神経細胞へのエネルギー供給の意義の解明
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22K06879
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
矢野 佳芳 (早川佳芳) 新潟大学, 医歯学系, 特任助教 (60397320)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢野 真人 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (20445414)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | RNA制御 / グリア / 選択的スプライシング / ピルビン酸キナーゼ / Quaking |
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| Outline of Annual Research Achievements |
中枢神経系における神経細胞とグリア細胞はグルコース代謝系において生化学的に大きな違いがあり、グリア細胞が神経細胞へのエネルギー供給を行うことでサポートをしていることが報告されている。これらのグリア細胞と神経細胞における代謝連関は、基礎的な細胞生物学だけでなく、神経系疾患を理解する上で重要であると考えられる。そこで、本研究では生化学的特性の差異を生み出す分子機構について解明し、グリア細胞と神経細胞における代謝連関の制御機構について明らかにすることを目的する。本研究では、神経系のグリア細胞の一つであるオリゴデンドロサイト(OLs)に強く発現するRNA結合蛋白質Quaking5(Qki5)に注目し、標的となるmRNAの選択的スプライシング制御の観点から解析を行う。
上記を踏まえ、研究期間全体において1)グリア細胞における特異的なエクソン及びQki5による制御エクソンを明らかにする、2）グリア細胞におけるQki5によるPkm1/2の制御およびグリア細胞におけるピルビン酸代謝、神経細胞の代謝動態との関連を明らかにする、3)さらにPkm1/2 におけるQki5の結合配列に基づき、Pkm1/2 スイッチを操作を可能とする核酸の技術を開発し、グリア細胞から神経細胞への乳酸供給の役割を解明する。これにより、神経系におけるグリア細胞-神経細胞の代謝連関の一端を解明し、神経系疾患における代謝機構の理解や創薬に繋がる分子基盤となる情報を得る。
初年度である本年度は、マウス培養オリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)を用いて、Qkの発現抑制を行った細胞(Qk-KD)およびコントロール細胞よりRNAを抽出し、トランスクリプトーム解析を行なった。細胞内の核に主に局在するQki5はmRNAの選択的スプライシング制御に大きく寄与しているため、選択的スプライシングを中心に包括的に制御エクソンの同定を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度である本年度は、マウスOPC細胞の培養系において包括的にQkiの標的RNAの同定を行うために、OPCにQk siRNAを導入し発現を抑制した上で、コントロールと比較してトランスクリプトーム解析を実施した。mRNAの定量解析により、Qk-KDでは多くの発現の変動するトランスクリプトを同定した。Qkファミリーそのものも選択的エクソンにより、Qki5,6,7のアイソフォームが存在し、Qki5は主に核に局在しmRNAの選択的スプライシングの制御、Qki6,7は主に細胞質に局在しmRNAの安定化や翻訳制御に関与している。そこで、OLego-Quantas解析ツールを用いて、選択的スプライシングの動態についても解析し、網羅的な制御エクソンの同定を行った。その結果、OPCのQk-KDおいて、2914エクソンの変動が認められQki5の選択的スプライシングの制御が明らかになった。
また、OPCと神経細胞の選択的エクソンについて比較し、OPC特異的エクソンを164同定し、このOPC特異的エクソンにおけるQkiの寄与の程度を検討したところ、約半数のエクソンの制御に関与していることが明らかとなった。さらに、この制御エクソンの一つとして、ピルビン酸キナーゼ(PKM)1/2の選択的スプライシングを同定した。解糖系の律速酵素の一つであるPKMはexon9の選択によりPKM1型、exon10選択によりPKM2型となる。QkiはOPCにおいてexon9を抑制することでPKM2の発現を促進している。すなわちQkiは選択的プライシング制御により細胞種特異的な代謝機構を制御する重要な因子であることがわかった。現在、マウス胎児脳を用いて解析したQki結合RNA部位の情報を元に、結合部位と制御エクソンの統合解析を進めている。以上にように、計画通りに進んでいるため、概ね順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はQkiが直接結合する標的mRNA部位を同定するためにOPCおいてHITS-CLIP法(タンパク質-RNA相互作用解析)を行い、PKM1/2の制御エレメントを一塩基解像度で同定を行う。HITS-CLIP法がうまく機能しない場合においては、以前に行なったマウス胎児脳を用いたHITS-CLIP解析のQki結合RNA部位を元にPKM1/2の選択的エクソンの選択に関与するRNA部位を予測する。さらに、予測されたQkiの結合部位ACUAAYを含む配列に相補的に結合するアンチセンス核酸(ASO)を設計しOPCに導入して、Qkiの結合を抑制した条件下でPKM1/2の量比の変動をqPCR法を用いて定量し、QkによるPKM1/2の制御を明らかにする。さらに、偏りなくOPCにおいて代謝に関与する標的RNAについても抽出し、PKM1/2と同様のストラテジーを用いて、その制御機構を明らかにし、細胞生物学的に重要な作用経路を明らかにする。
また、Qki蛋白質はもう一つの主要なグリア細胞であるアストロサイトにおいても発現し、機能していることがすでに報告されている。アストロサイトではグリコーゲンの形でエネルギーを貯蔵しており、乳酸に代謝し神経細胞に供給することで、長期記憶の形成に寄与しているとの報告があり、大変興味深い。アストロサイトについても同様に培養系を立ち上げ、アストロサイト細胞系譜におけるQkiの標的mRNAを包括的に解析を進める予定である。
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