2022 Fiscal Year Research-status Report

Functional role of the translational regulator Gcn1 in a dopaminergic neuron

Research Project

Project/Area Number	22K06891
Research Institution	Hirosaki University
Principal Investigator	葛西秋宅弘前大学, 医学研究科, 助教 (20609664)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	二階堂義和弘前大学, 医学研究科, 講師 (50613478) 岩崎信太郎国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 主任研究員 (80611441)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	Gcn1 / Gcn2 / 翻訳 / Disome / パーキンソン病
Outline of Annual Research Achievements	タンパク質恒常性の破綻と異常タンパク質の凝集は神経変性疾患に関わることが知られているが、神経変性にいたる前段階であるストレス発生の機序については不明な点が多い。近年、リボソーム品質管理 (RQC) に関わる因子が翻訳停滞により衝突したリボソーム (disome) を認識し、翻訳の促進または中止を制御し、RQC因子の変異が神経変性を引き起こすことが分かってきた。アミノ酸飢餓応答因子Gcn1はリボソームおよびプロテインキナーゼであるGcn2と結合し、アミノ酸飢餓により増加した非アミノアシル化tRNAによるGcn2活性化を仲介する。Gcn2は翻訳開始因子eIF2αをリン酸化することで翻訳開始を抑制し、ATF4活性化を介してアミノ酸合成に関わる遺伝子発現を誘導する。酵母において非ストレス存在下でGcn1がdisomeに結合し、難翻訳コドンによるフレームシフトを抑制することが明らかとなったが、哺乳類ホモログが同様の機能を持つか不明である。 Gcn1による翻訳調節について、Gcn1を欠失したマウス胎仔由来線維芽細胞（MEF）およびヒト白血病細胞株HAP1を用いてリボソームプロファイリングを行った。Gcn1欠失によるGcn1自体の翻訳低下およびmRNA増加が見られたほか、複数mRNAの共通した配列でdisomeの増加が認められた。しかしながら、HAP1細胞は増殖が早い影響でGcn2活性化による翻訳抑制およびATF4標的遺伝子の誘導が見られたため、培養条件を見直し、再度解析を行う。ドーパミン作動性ニューロン特異的Gcn1ノックアウト（CKO）マウスについてはGcn1 floxマウスとTh-CreERマウスの交配中であり、ホモのfloxのコロニーが得られしだいタモキシフェン投与によるCKOマウスの作製を行う。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason Gcn1を欠失したMEFおよびHAP1細胞のリボソームプロファイリングを実施し、Gcn1依存的に翻訳制御を受けるmRNAを同定したものの、HAP1細胞については増殖が早い影響でアミノ酸飢餓応答が起きており、現在、アミノ酸飢餓応答が起こらない条件で再度リボソームプロファイリング解析を行うため、培養条件の検討を行っている。ドーパミン作動性ニューロン特異的Gcn1 CKOマウスについてはGcn1 floxマウスとTh-CreERマウスの交配を進めていたが、現在ホモのGcn1 floxマウスが生まれはじめたところで、予備実験を行える個体数に至っていない。
Strategy for Future Research Activity	Gcn1欠失細胞のリボソームプロファイリングについてはHAP1細胞の培養条件を検討後、再度リボソームプロファイリングを実施し、特にマウスとヒトで共通するmRNAやコドン、モチーフ配列などがないか解析する予定である。また、共通してdisomeの増加が見られたmRNAについてはタンパク質レベルでの変動を進めている。再解析で同定した遺伝子についてもmRNAレベルおよびタンパク質レベルでの発現を確認する。ドーパミン作動性ニューロン特異的Gcn1 CKOマウスの表現型解析については、ホモのfloxのコロニーが得られしだいタモキシフェン投与によるCKOマウスの作製を行う。タモキシフェン投与条件によるCKO効率の予備実験にはヘテロのマウスを使用し、野生型およびfloxアリルのジェノタイピングを定量PCRで評価できるか検討する。また、ドーパミン作動性ニューロンにおけるGcn1欠失を免疫染色で評価する必要があるため、以前作製した全身性CKOマウスの組織切片を用いて抗体の条件検討を行う。ドーパミンニューロン特異的CKOマウスを作製後は主に運動機能に注目した行動解析を実施し、コントロールと差が見られなければ、MPTP投与によるパーキンソン病モデルを作製して行動解析を行う。運動機能に差が見られた場合はドーパミンニューロンの変性について解析する。