2022 Fiscal Year Research-status Report
長鎖非コードRNAによるTLS相分離を介した新規の転写制御機構の解明
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22K06904
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
黒川 理樹 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (70170107)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 長鎖非コードRNA / TLS / FUS / 相分離 / ALS / 天然変性領域 / IDR / 転写制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の核心をなす問いは、「lncRNAはTLSの相分離に作用し転写を制御するのか」である。これに答えるために目的を設定した。目的は、相分離により形成される液滴に作用して転写を抑制するlncRNAを見いだすことである。これにより、新規の転写抑制機構を示すことになる。この目的を達成するために、2022年度はTLSに結合するlncRNAの検出法の確立を目指した。具体的には、GST-TLSにヒトHeLa細胞総RNAを結合させ、lncRNAを検出する方法を確立した。まず、大腸菌発現のGST-TLSを調製して、内因性の大腸菌RNAをMicrococcal Nuclease処理で除去した。このGST-TLSにHeLa細胞総RNAを結合させた。結合RNA画分から、RNA精製キットでTLS結合RNAを調製した。このTLS結合RNAから相補的なCyanine3標識のcRNAを合成し、ヒトlncRNAマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせた。シグナル強度をスキャナーで測定した。出発物質であるHeLa細胞総RNAから、精製されたGST-TLS結合RNAの中でシグナルが2倍以上に上昇したRNA配列は1700種類以上が見いだされた。これらの配列で、10倍以上増加したRNAが50件ほど、20倍以上が10件以上となった。次年度は、これらのlncRNAが実際にTLSに結合し、相分離制御作用を有するかを検証していく。この成果は、相分離に作用して転写を抑制する新規のlncRNAを同定することになる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画では、Ⅰ.TLSに結合するlncRNAの検出法の確立、Ⅱ.TLSに結合するlncRNAの検証,Ⅲ.目的のlncRNAを選択する実験法の確立、以上3項目を3年間で実行する実験計画を作成した。初年度で、Ⅰを終えてⅡに入ろうとしているので、計画は順調に進展しているといえよう。
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| Strategy for Future Research Activity |
2023年度は、初年度で得られたRNA配列がTLSに結合することを検証する。シグナルが20倍以上に上昇したlncRNA配列からビオチン標識RNAオリゴを合成して、実際にTLSと結合することを確認する。現在までに上位4種類のRNA配列について、GST-TLSへの結合とHeLa細胞核抽出液(NE) 中のTLSとの結合が確認された。予備的実験により、上位4種類のlncRNAがTLSと結合した。初年度までに得られた1700種類ほどのRNA配列に関して、実験的にTLSに結合する新規lncRNAであることを検証する予定である。これを達成後は、TLSに結合するlncRNAから、相分離を制御するものを選択していく予定である。
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| Causes of Carryover |
研究費の有効利用と、実験過程の効率化を追求した成果として、研究費に余裕が生じた。来年度に繰り越しになる研究費も研究課題の効率的な遂行に適切に用いていく。
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