2022 Fiscal Year Research-status Report

Calpain３変異による肢帯型筋ジストロフィーの発症メカニズムの解明

Research Project

Project/Area Number	22K07014
Research Institution	Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Principal Investigator	久恒智博公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 主席研究員 (10321803)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2025-03-31
Keywords	骨格筋 / 筋ジストロフィー
Outline of Annual Research Achievements	肢帯型筋ジストロフィーR1 (limb-girdle muscular dystrophy R1: LGMDR1)は、カルシウム依存性プロテアーゼのCalpain3を原因遺伝子とする進行性の筋ジストロフィーである。現在までに治療法は確立しておらず、LGMDR1の治療法の確立のためにもLGMDR1発症機序の解明は重要と考えられる。近年Calpain3を欠損したマウス(CAPN3KO)で筋小胞体のカルシウム貯蔵量が減少することが報告された。さらに、筋小胞体のカルシウム貯蔵量の減少がCalpain3の活性中心変異体のノックインマウス(C129S-KI)ではみられないことが明らかになった。このことから、Calpain3は酵素活性に依存しないメカニズムにより、筋小胞体カルシウム貯蔵量を制御することが考えられる。小胞体カルシウム貯蔵量の減少は細胞にとってストレスであるため、筋ジストロフィー発症機構に深い関わりがあると予想し、本研究ではCalpain3が筋小胞体カルシウム貯蔵量を制御する機構を明らかにすることを目指した。まず、本年度はCalpain3-WT, KO, KIマウス骨格筋より筋幹細胞を酵素処理法により取得し、in vitroで筋細胞に分化させ、筋細胞内のカルシウム動態を蛍光カルシウム指示薬により測定した。刺激はカルシウムポンプ阻害剤により行った。また、様々なCalpain3変異体を発現するプラスミドを構築し、HEK293細胞やCOS細胞、培養筋細胞においてその発現を確認した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason これまでにWTとKOマウスの筋細胞に細胞内カルシウム動態の大きな違いが見い出せていない。培養条件や刺激条件などの検討が必要と考えられる。
Strategy for Future Research Activity	LGMDR1は発症後徐々に進行することが知られている。このためCalpain3欠損型マウスに見られるカルシウム動態の異常をin vitroで検出するには、より長期の培養期間を必要とする可能性が考えられる。長期間の培養法の確立を目指す一方、成体のマウスより骨格筋線維を調製して、そのカルシウム動態を調べる方法も試すことを考えている。
Causes of Carryover	今年度はカルシウム動態の実験が思うように進まなかったため、消耗品の購入が少なくなった。次年度にカルパイン3KOマウスとWTマウスのRNAseqを外注する費用に充てる。