2023 Fiscal Year Research-status Report
マラリア原虫メロゾイトの細胞内小器官デンスグラニュールタンパク質の網羅的解析
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22K07041
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
森田 将之 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 講師 (60709632)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | メロゾイト / デンスグラニュール / 免疫電子顕微鏡法 / AGIAタグ / EXP2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マラリア原虫メロゾイトは赤血球寄生に特化した細胞内小器官を有する。本研究はその中でも近年の代表者らの研究でマラリア原虫の侵入や寄生維持に重要な分子が含まれることが見出されてきたデンスグラニュール (DG) の全貌を明らかにすることを目的としている。代表者の予備研究からDGは、RESAが局在するDG、SUB1が局在するDG、そのどちらも局在しないDG、の少なくとも3種に免疫電子顕微鏡法 (IEM) によって分類できることが分かっており、それらが独自に機能して原虫の赤血球寄生を緻密に制御していると考えられる。このことから既知DGタンパク質および代表者が独自に同定したDGタンパク質候補がどのDGに局在するか明らかにするためにIEMを行った。前年度にシングルクロスオーバーによる遺伝子組換えでAGIAタグをDGタンパク質候補のC末端へ融合させた。今年度はウサギ抗AGIAモノクローナル抗体を用いたIEMを行ったが、その抗体反応はほとんど検出できなかった。本シングルクロスオーバーではT2AスキップペプチドによってAGIAタグ塩基配列の下流の翻訳がスキップされて薬剤耐性遺伝子が単独で発現されるはずであるが、一部がスキップされずAGIAタグのC末端に薬剤耐性タンパク質が融合していた。これによりIEMで検出できるAGIAタグが減少したことが考えられた。そのため、CRISPR/Cas9システムによるダブルクロスオーバーでAGIAタグをマラリア原虫のゲノムDNAへ組み込むことにし、既知DGタンパク質であるEXP2のC末端へAGIAタグを導入することに成功した。IEMによりRESAとの共局在を観察した結果、RESAが局在するDGにEXP2は局在しないことがわかった。それに加えて、RESAとEXP2の両方が局在しないDGも観察され、未知のDG様オルガネラがさらに存在することが示唆される結果を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
シングルクロスオーバーによって作製したAGIAタグ融合熱帯熱マラリア原虫はウサギ抗AGIAモノクローナル抗体の反応シグナル量が低下していることが考えられた。このことからCRISPR/Cas9システムによるダブルクロスオーバーで遺伝子組換え原虫の作出を新たに行ったため遅れが生じた。
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| Strategy for Future Research Activity |
EXP2はメロゾイト内でRESA陽性のDGには局在しないことがわかった。次に、EXP2はSUB1陽性のDGに局在するか明らかにするためにIEMによるSUB1とEXP2-AGIAの共局在解析を行う。それとともに、RESAまたはSUB1にAirIDを融合させたマラリア原虫の作製を進める。
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| Causes of Carryover |
他の研究費で購入したプラスチック器具や遺伝子組換え用試薬等の消耗品を使用したため、本研究費の使用額が抑えられた。次年度は、ゲノム編集に必要な遺伝子の合成を外部企業へ委託することを計画している。
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