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2022 Fiscal Year Research-status Report

サルマラリア原虫接着分子とヒト受容体の結合解析

Research Project

Project/Area Number 22K07043
Research InstitutionNagasaki University

Principal Investigator

坂口 美亜子  長崎大学, 熱帯医学研究所, 助教 (50400651)

Project Period (FY) 2022-04-01 – 2025-03-31
KeywordsPlasmodium knowlesi / サルマラリア原虫 / 二日熱マラリア / 接着現象
Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、二日熱マラリアの重篤化に関与する Plasmodium knowlesi 寄生赤血球の接着機構を解明するため、P. knowlesi 接着分子が結合するヒト血管内皮細胞の受容体を同定し、相互作用を解析することである。
まず最初に、すでに同定している P. knowlesi 接着分子の7つのシステインリッチドメイン(C1-C7)のうち、どの部位がヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に結合するのかを評価するため、細胞外領域の全長及び各ドメインを含む小さな領域について GST タグを付与した組換えタンパク質をコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系により作製したところ、想定していたよりも組換えタンパク質の収率がよくなく、またあるドメインで高い結合性が示されたものの新たに作製した組換えタンパク質において再現性が得られなかったため、本方法での結合解析は断念することになった。その代わりに、接着分子のドメインの細胞外領域のうちいくつかのドメインを除いた短い接着分子(C1-C4あるいはC4-C7)を発現する組換え P. knowlesi 原虫を作製し、どのドメインが接着に関与するのかについて HUVEC への結合性を評価することにした。
また、HUVEC におけるヒト受容体の同定の際の参考情報とするため、 P. knowlesi 寄生赤血球の接着においてヒト受容体にはタンパク質成分が含まれるのかを確認する目的で、まず培養した HUVEC に対してかなり低濃度のプロテアーゼ処理を行い接着アッセイを試みた。しかし細胞の変形や部分的なプレート上の接着の阻害などが避けられず、ヒト受容体のみをうまく除去することができなかった。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初計画していた P. knowlesi 接着分子の細胞外領域の全長及び各ドメインを含む小さな領域についてコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系により作製した組換えタンパク質は、サイズにより収率が芳しくないものがあり、また新たに作製した組換えタンパク質は再現性が得られなかったことから本方法での結合解析は取り止め、その代わりに異なる短いドメインの接着分子を発現する組換え P. knowlesi 原虫を作製し、結合部位の評価を行うこととした。
また、P. knowlesi 接着分子と結合するヒト受容体を評価するため、培養した HUVEC に対してかなり低濃度のプロテアーゼ処理を行ったが、細胞の形態が変形してしまいプレート上での維持が困難なため接着アッセイを行うことができなかった。計画していたプロテアーゼ処理などによるヒト受容体の評価について同定の際の参考情報はまだ得られていないが、次に計画している P. knowlesi 接着分子を用いたヒト受容体候補群の探索には影響がないため、予定通りに実験を行うことが可能である。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究の予定として、新たに作製した P. knowlesi 接着分子ドメインの細胞外領域のうちいくつかのドメインを除いた短い接着分子(C1-C4あるいはC4-C7)を発現する組換え P. knowlesi 原虫を用いて HUVEC に対する接着アッセイを行い、どのドメインが関与するのかについて結合性の評価を行う。
そして、 P. knowlesi 接着分子を用いてヒト受容体候補群の探索を行う。細胞表面をビオチン標識した HUVEC に対し、Myc エピトープタグを標識した P. knowlesi 接着分子を強発現する組換え P. knowlesi 寄生赤血球と共培養して接着させた後、タンパク質架橋剤により P. knowlesi 接着分子と HUVEC 受容体を架橋する。架橋剤の濃度や反応時間等の条件検討により反応を最適化した後、anti-Myc 抗体を用いて試料抽出液から P. knowlesi 接着分子と HUVEC 受容体を共免疫沈降させる。そして、液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS/MS)により P. knowlesi 接着分子に特異的に特異的に結合する HUVEC 分子を探索し、受容体候補のリストを作成する。

Causes of Carryover

当初計画していた組換えタンパク質を用いた P. knowlesi 接着分子の結合部位の評価や、HUVEC に対するプロテアーゼ処理などによるヒト受容体の評価に関する接着アッセイができなくなったことから、使用予定としていた培養関係の試薬類や器具類の購入について次年度使用額として回すことになった。

  • Research Products

    (6 results)

All 2023 2022

All Journal Article (4 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 4 results,  Open Access: 4 results) Presentation (2 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results)

  • [Journal Article] Effect of geranylated dihydrochalcone from Artocarpus altilis leaves extract on Plasmodium falciparum ultrastructural changes and mitochondrial malate: Quinone oxidoreductase2023

    • Author(s)
      Hidayati Agriana Rosmalina、Melinda、Ilmi Hilkatul、Sakura Takaya、Sakaguchi Miako、Ohmori Junko、Hartuti Endah Dwi、Tumewu Lidya、Inaoka Daniel Ken、Tanjung Mulyadi、Yoshida Eri、Tokumasu Fuyuki、Kita Kiyoshi、Mori Mihoko、Dobashi Kazuyuki、Nozaki Tomoyoshi、Syafruddin Din、Hafid Achmad Fuad、Waluyo Danang
    • Journal Title

      International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance

      Volume: 21 Pages: 40~50

    • DOI

      10.1016/j.ijpddr.2022.12.001

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Identification of surfactin as an anti-severe fever with thrombocytopenia syndrome virus multi-target compound extracted from the culture broth of marine microbes2023

    • Author(s)
      Urata Shuzo、Takouda Jun、Watanabe Yoshihiro、Sakaguchi Miako、Sakurai Yasuteru、Inahashi Yuki、Iwatsuki Masato、Yasuda Jiro、Tanaka Yoshimasa、Takeda Kohsuke
    • Journal Title

      Frontiers in Virology

      Volume: 2 Pages: 1064265

    • DOI

      10.3389/fviro.2022.1064265

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] SICA-mediated cytoadhesion of Plasmodium knowlesi-infected red blood cells to human umbilical vein endothelial cells2022

    • Author(s)
      Chuang Huai、Sakaguchi Miako、Lucky Amuza Byaruhanga、Yamagishi Junya、Katakai Yuko、Kawai Satoru、Kaneko Osamu
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 12 Pages: 14942

    • DOI

      10.1038/s41598-022-19199-0

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Development of an imaging system for visualization of Ebola virus glycoprotein throughout the viral lifecycle2022

    • Author(s)
      Furuyama Wakako、Sakaguchi Miako、Yamada Kento、Nanbo Asuka
    • Journal Title

      Frontiers in Microbiology

      Volume: 13 Pages: 1026644

    • DOI

      10.3389/fmicb.2022.1026644

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] SICA-mediated cytoadhesion of Plasmodium knowlesi-infected red blood cells to human umbilical vein endothelial cells.2022

    • Author(s)
      Chuang H, Sakaguchi M, Lucky BA, Yamagishi J, Katakai Y, Kawai S, Kaneko O.
    • Organizer
      The 20th Awaji International Forum on Infection and Immunity.
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] SICA-mediated cytoadhesion of Plasmodium knowlesi-infected red blood cells to human umbilical vein endothelial cells.2022

    • Author(s)
      Chuang H, Sakaguchi M, Lucky BA, Yamagishi J, Katakai Y, Kawai S, Kaneko O.
    • Organizer
      The 71st Annual Meeting of American Society of Tropical Medicine and Hygiene.
    • Int'l Joint Research

URL: 

Published: 2023-12-25  

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