2023 Fiscal Year Research-status Report
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22K07043
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
坂口 美亜子 長崎大学, 熱帯医学研究所, 助教 (50400651)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | Plasmodium knowlesi / サルマラリア原虫 / 二日熱マラリア / 接着現象 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、二日熱マラリアの重篤化に関与する Plasmodium knowlesi 寄生赤血球の接着機構を解明するため P. knowlesi 接着分子が結合するヒト血管内皮細胞の受容体を同定し、相互作用を解析することである。
まず最初に、これまでにすでに同定している P. knowlesi 接着分子を構成している7つのシステインリッチドメイン（C1-C7）のうち、どのドメイン部位がヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）に結合するのかを確認するため、いくつかのドメインを除いた短いサイズの接着分子（C1-C4あるいはC4-C7など）を発現する組換え P. knowlesi 原虫の作出を試みた。プラスミド作製のため、部位特異的変異導入による方法でいくつかのドメインを欠失した変異体を取得するためにインバース PCR と酵素処理を行ったが、得られたプラスミドの目的配列の一部が欠失や変異を起こしており、プライマーの変更など条件を変えて繰り返し実験を行ったが目的の正しい配列を得ることができなかった。
そこで、昨年度に上手くいかなかったコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系による組換えタンパク質の作製についてプロトコールの条件設定を検討し直し、溶出の際のバッファー組成や組換えタンパク質の合成の際のスケールなどの修正を行った結果、得られる組換えタンパク質の濃度が上昇し収率が向上した。
現在はこれら作製した組換えタンパク質を用いて HUVEC への結合性を評価するため、Cell ELISA の条件設定を行っているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
最初に P. knowlesi 接着分子の細胞外領域のいくつかのドメインを除いた異なる短い接着分子を発現する組換え原虫を作出するためのプラスミド作製において、様々な条件設定の変更を行ったが正しい配列が得られなかったため、HUVEC に対する結合解析を行うまでには至らなかった。一方、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系による組換えタンパク質の作製方法について変更したところ、得られる組換えタンパク質の収率が改善されたため、これらの組換えタンパク質を HUVEC に対する結合解析やヒト受容体候補群の探索に使用することが可能である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究の予定として、P. knowlesi 接着分子の細胞外領域のうち短いドメインを含む組換えタンパク質を用いて HUVEC に対する結合解析を行い、 7つのシステインリッチドメインのうちどのドメインが接着に関与するのかを調べる。また、この接着分子を使用して、ヒト血管内皮細胞においてどの受容体が結合できるのかについて評価する。HUVEC と共培養して接着させ、タンパク質架橋剤の濃度や反応時間などの条件検討を行った後、タグに対する抗体を用いて接着分子と HUVEC 受容体を共免疫沈降させる。
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| Causes of Carryover |
予定していた HUVEC の結合解析や P. knowlesi 接着分子と HUVEC との共免疫沈降ができなくなったことから次年度使用額が生じた。次年度に繰り越した経費については、使用予定としていた上記の実験用試薬類や器具類の購入に充てる予定である。
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