敗血症治療への応用を目指した好中球細胞外小胞による敗血症病態改善メカニズムの解析

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K07056
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 熊谷 由美 順天堂大学, 医学部, 助教 (90277591)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 長岡 功 順天堂大学, 保健医療学部, 特任教授 (60164399)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 敗血症 / 好中球 / 細胞外小胞 / レポーターマウス

Outline of Annual Research Achievements

研究代表者はこれまでに、マウスの骨髄から単離した好中球を生体防御ペプチドLL-37で刺激したときに放出された細胞外小胞 (Extracellular vesicles, EV) LL-37-PMN-EVは、敗血症モデルマウスの致死率を減少させること、また、特に肺において、炎症の程度を軽減させることを明らかにしてきた。現在は、LL-37-PMN-EVの生理的な標的細胞を検出するために、好中球由来のEVにCreをloadさせ、loxP-red fluorescent-loxP-green fluorescentの配列を導入したレポーターマウスを用いる系を構築している。そのために、
1. 非常に困難で世界的にも殆ど成功例がない好中球の高効率なtransfectionに成功し、この好中球に由来するEVにCreを効率よくlaodする系を確立した。
2. レポーターマウスの構築に用いるレポータープラスミドを作製し、培養細胞の系で機能することを確認した。
3. 1. のCre-laod EVが、レポータープラスミドを有する培養細胞に取り込まれて、Cre-loxP系が作動することを確認した。
4. 2.のレポータープラスミド中の、loxP-red fluorescent-loxP-green fluorescentのカセットを、Rosa26 armを持つプラスミドに組換え、ES細胞をtransfectionして組換えES細胞を樹立し、これを親マウスに移植して、遺伝子組み換えマウスを得た。しかし、目的のフラグメントの挿入が確認できなかった。現在カセットのデザインを再検討している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

レポーターマウスの構築を試みているが、目的のフラグメントの挿入が確認できず、再度レポーター用のカセットのデザインを試みているため。

Strategy for Future Research Activity

１． 一細胞解像度、三次元的解析によるEVの標的細胞の同定 (in vivo・ex vivo実験):EVが取り込まれた細胞が蛍光を発するレポーターマウスを利用して、好 中球EVの肺における標的細胞を、組織透明化技術・一細胞解像度のイメージング技術を利用して、三次元的に一細胞レベルで解析する。 2. EVの標的細胞に対する抗炎症・細胞死抑制作用の評価 (ex vivo・in vitro実験) 3. 抗炎症・細胞死抑制作用に関係する好中球EVの因子の同定 (ex vivo・in vitro・ in vivo実験) 4. ヒト好中球由来EVへの適用 (ex vivo・ in vitro実験) :ヒト好中球をLL-37で刺激した時に生成されるEVにも、標的細胞に対する同様の抗炎症・細胞死抑制

Causes of Carryover

以前の科学研究費補助金を使用した研究は想定以上に進捗し、予算に剰余が出た。そのため、以前の余った予算で、こちらで申請した研究を行なっている。２０２２年度はこの剰余予算で研究が行なえたため、こちらの補助金の使用はまだ開始していない。２０２３年度は、こちらの補助金を使用して申請書に記載された研究を継続する予定である。