2023 Fiscal Year Research-status Report
敗血症治療への応用を目指した好中球細胞外小胞による敗血症病態改善メカニズムの解析
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22K07056
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
熊谷 由美 順天堂大学, 医学部, 助教 (90277591)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
長岡 功 順天堂大学, 保健医療学部, 特任教授 (60164399)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 敗血症 / 好中球 / 細胞外小胞 / LL-37 / レポーターマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者らはこれまでに、マウスの骨髄から単離した好中球を生体防御ペプチドLL-37で刺激したときに放出される細胞外小胞 (Extracellular vesicles, EV) LL-37-PMN-EVが、敗血症モデルマウスの致死率を減少させること、また、特に肺において炎症の程度を軽減させることを明らかにしてきた。そして特に本年度は、LL-37-PMN-EVの敗血症マウスにおける生理的な標的細胞を検出するためのレポーターマウスを構築した。このマウスは、loxP-tdTomato-loxP-EGFP配列が染色体に挿入されており、細胞は赤色蛍光を発するが、Creを含有するEVが取り込まれた細胞では、loxPサイトで部位特異的組み換えが起きて、緑色蛍光を発するようになる。
レポーターマウスは次の方法で構築した。１．loxP-tdTomato-loxP-EGFP配列をRosa26 armを持つプラスミドに挿入した。２．C57BL6/N系統のオスに由来する5ES細胞をこの組み換えプラスミドでtransfectionして組換えES細胞を樹立した。３．このES細胞を仮親マウスに移植して、得られた仔マウスは、遺伝子組み換えマウス（レポーターマウス）と考えられる。
またレポーターマウスは次の方法で確認した。１．採取した臓器に由来する細胞、および体液細胞は赤色蛍光を発した。２．ゲノム解析の結果、目的のフラグメントが挿入されていることが明らかとなった。３. LL-37-PMN-EVをレポーターマウスの細胞に作用させると、体液由来の一部の細胞で緑色蛍光を発するようになった。現在は標的細胞と考えられる細胞をin vitroで培養し、LL-37-PMN-EVを作用させたときの変化を調べている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
好中球由来の細胞外小胞のin vivoにおける生理的な標的細胞を探索するためのレポーターマウスを構築し、Creを含有する好中球由来の細胞外小胞を作用させると、実際にレポーター系が作動することを確認した。また現在、標的と考えられる細胞に対する作用を解析しており、ほぼ計画通りに侵攻していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
LL-37-PMN-EVの標的と考えられる体液由来の細胞への作用を現在解析中であるが、特に今後は次の点について詳細に解析をする予定である。
１．体液由来の細胞のみならず、組織内の標的細胞を探索するために、レポーターマウスにLL-37-PMN-EVを投与し、各組織を採取したのちに、組織透明化、3次元・一細胞解像度のイメージングを行なう。
2. EVの標的細胞に対する作用を、特に抗炎症・細胞死抑制という観点から解析する。
3. 抗炎症・細胞死抑制作用に関係するLL-37-PMN-EVの因子を同定する。
4. ヒト好中球由来EVへの適用 (ex vivo・ in vitro実験) :ヒト好中球をLL-37で刺激した時に生成されるEVにも、標的細胞に対する同様の抗炎症・細胞死抑制作用があるかを確認する。
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| Causes of Carryover |
計画した時点より、マウスその他の消耗品が少なくても結果を得ることができたため、予算を次年度以降に回すことができている。その予算は、上記の今後の研究計画を遂行するために用いる予定である。また特に2024年度は国際学会での発表が決定しているため、その旅費や参加費に充てる予定である。
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[Journal Article] Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches2024
Author(s)
Welsh, J. A., Goberdhan, D. C. I., O’Driscoll, L., Buzas, E. I., Blenkiron, C., Bussolati, B., Cai, H., Di Vizio, D., Driedonks, T. A. P., Erdbrugger, U., Falcon-Perez, J. M., Fu, Q.-L., Hill, A. F., Lenassi, M., Lim, S. K., Mahoney, M. G., Mohanty,.. .Kumagai, Y.,... Witwer, K. W
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Journal Title
Journal of Extracellular Vesicles
Volume: 13
Pages: e12404
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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