Functional analysis of botulinum toxin complex with enhanced oral toxicity

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K07057
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture
• Principal Investigator: 相根 義昌 東京農業大学, 生物産業学部, 教授 (00624660)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 宮下 慎一郎 東京農業大学, 生物産業学部, 助教 (20883292)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: ボツリヌス菌 / 血球凝集素 / 一次構造解析

Outline of Annual Research Achievements

ボツリヌス食中毒を引き起こすボツリヌス神経毒素（BoNT）は、Clostridium botulinumによって産生される。BoNTは、非毒非血球凝集素と血球凝集素（HA）の複合体（HA-33、HA-17およびHA-70から構成される）が会合したProgenitor Toxin Complex（PTC）を形成する。PTCは純粋なBoNTよりも高い経口毒性を示すため、PTCの形成は経口毒性を発揮する上で重要な機能を有するものと推測されている。我々は、ボツリヌスC型菌Yoichi株が産生するPTC（33vPTC）を構成するHA-33は、同じC型菌の参照株が産生するPTC（wtPTC）のそれと比較し、C末端側領域において複数のアミノ酸残基の置換が生じていることを明らかにした。さらに、昨年度の研究で33vPTCはwtPTCよりも90倍経口毒性が高いことを示した。一方で、先の報告において、33vPTC由来HA-33のC末端アミノ酸配列分析により、C末端領域に31アミノ酸残基の欠落が生じている可能性を示した（2002年）。そこで、本年度は大腸菌を用いて変異体HA-33の作製を試みた。しかし、C末端の欠落したタンパク質は不安定であったことから、C末端領域のアミノ酸残基の欠落の有無に疑問が残った。本研究では、改めて先の報告とは異なる手法で33vPTC由来HA-33の一次構造解析を行なった結果、欠落すると考えられていた領域の断片がHA-33標品に存在すること、にもかかわらず、SDS-PAGEにおける移動度が推定されるそれよりも顕著に小さくなることを見出した。以上の結果は、33vPTCを構成するHA-33にはアミノ酸の欠落はないことを示した。さらに、33vPTC由来HA-33の組み換えタンパク質の作製にも成功した。この結果をもとに、wtPTC由来HA-33との機能性比較が行えるようになった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

組換えタンパク質によるHA-33の作製が可能になったことにより、次項で示す今後の研究につなげることができたため。

Strategy for Future Research Activity

本年度の研究によって作製した33vPTCおよびwtPTC由来HA-33の糖に対する結合親和性を測定比較するとともに、糖鎖との結合に関わると考えられるアミノ酸に変異を入れた組換えタンパク質を作製し、それぞれのHA-33と糖との結合に関わるアミノ酸の特定を行い、HA-33と細胞との結合様式を明らかにする。

Causes of Carryover

本年度の事業が予定よりスムーズに進んだことから、必要経費が予定より少額で済んだ。昨今の旅費等の高騰を鑑み、次年度に必要な学会参加のための旅費を次年度に繰り越すこととした。