2022 Fiscal Year Research-status Report
ディフィシル菌溶菌酵素の菌種特異性に関する分子メカニズムの解明
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22K07061
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| Research Institution | Matsuyama University |
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Principal Investigator |
関谷 洋志 松山大学, 薬学部, 准教授 (70454890)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
神鳥 成弘 香川大学, 医学部, 教授 (00262246)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | ディフィシル菌 / 溶菌酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細菌の溶菌酵素は、ペプチドグリカンを分解する酵素であり、通常、触媒ドメインと細胞壁結合ドメインで構成されている。また、菌種特異的に溶菌活性を持つものがある。ペプチドグリカンのペプチド鎖は菌種によって異なる構造を持ち、これに作用する溶菌酵素（アミダーゼとエンドペプチダーゼ）は、触媒ドメインが菌種特異性に大きく寄与していると考えられる。しかし、その分子メカニズムは解明されていない。本研究は、医療現場で脅威となっているディフィシル菌のアミダーゼとエンドペプチダーゼ活性を持つ溶菌酵素群について、それらの菌種特異性と立体構造を明らかにし、それらを比較解析することにより菌種特異性メカニズムを分子レベルで解明することを目的とする。
本年度、ディフィシル菌のゲノム配列から溶菌酵素遺伝子と推定されたCD09610(ecd09610)の遺伝子クローニングを行い、解析を行った。Ecd09610は、N末端にドメイン構造はみられないが、C末端にグルコサミニダーゼ及びエンドペプチダーゼと相同な2つの触媒ドメインが存在した。グルコサミニダーゼとエンドペプチダーゼの2つの触媒ドメインを含む遺伝子をそれぞれクローニングし、N末端にヒスチジンタグ付きのタンパク質として大腸菌で発現させた。精製したタンパク質は、ペプチドグリカンに特徴的なペプチド架橋を持つディフィシル菌に対してほぼ特異的に溶解活性を示した。この種特異性は、結合よりもむしろ基質切断活性が寄与していると推定された。また、それらのタンパク質は熱安定性があり、特にグルコサミニダーゼドメインは100℃まで活性を保持していた。さらに、これらのタンパク質の至適pHと塩濃度を決定した。それらの特性は、抗菌剤としての溶菌酵素の利用に適していると考えられる。
また、その他のエンドペプチダーゼやアミダーゼの候補遺伝子についても解析を行なっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在、Ecd09610のグルコサミニダーゼドメイン、エンドペプチダーゼドメインの結晶化を試みている。また、グルコサミニダーゼドメインのアミノ酸変異体を作製し、溶菌活性に重要なアミノ酸の同定も試みている。さらに並行して、ディフィシル菌のエンドペプチダーゼとアミダーゼの推定遺伝子の産物の解析を進めている。
概ね順調に研究は進んでいるが、見出しているエンドペプチダーゼ、アミダーゼ遺伝子のうち、まだ解析を行うことができていないものもあるが、随時解析を進める予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、まだ未着手の推定のエンドペプチダーゼ、アミダーゼ遺伝子の産物の解析を行い、解析の進んだものから触媒ドメインの結晶構造を明らかにする。得られた触媒ドメインの構造から、それらの菌種特異性と立体構造を明らかにし、それらを比較解析することにより菌種特異性メカニズムを分子レベルで解明することを目的とする。
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| Causes of Carryover |
当該年度に使用予定であったが、年度後半に購入した物品が想定より安く納品されたために若干の当該助成金の次年度使用額が生じた。次年度に研究を実施する際に物品費として使用する。
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