2022 Fiscal Year Research-status Report
病原細菌由来のフィブロネクチン結合タンパク質による付着性と創傷治癒遅延の解析
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22K07080
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| Research Institution | Okayama University of Science |
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Principal Investigator |
松永 望 岡山理科大学, 理学部, 講師 (30780142)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
片山 誠一 岡山理科大学, 理学部, 教授 (70169473)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 宿主細菌相互関係 / フィブロネクチン / デルマトポンチン / フィブロネクチン結合タンパク質 / 創傷治癒 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
宿主組織に対する病原細菌の付着因子は感染症成立のため重要である。付着因子の一つにフィブロネクチン(Fn)結合タンパク質(Fbps)が知られている。近年、Fbpsは付着能以外にも、バイオフィルム形成や宿主組織・細胞内への侵入などの別の機能を有することが明らかとなっている。
ウェルシュ菌は十数種類の毒素を産生し、創感染により不可逆的な組織破壊をもたらすガス壊疽を引き起こす。申請者らはFnが本菌と宿主コラーゲンとの結合に関与していることを見出し、本菌のFbps (FbpA-FbpD)を特定した。また、その他菌体外に表出しているautolysin(Acp)やglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)もFnとの結合に関与していることを見出した。
その後、FbpA・FbpBは細胞質に存在し、FbpC・FbpDは菌体外に表出していることが分かった。さらにFbpA・FbpBはFnと結合するよりも生体内でFn線維化を促進するデルマトポンチン(DPT)に強固に結合し、そのはたらきを抑制していることがわかった。Fn線維化は初期創傷治癒過程において重要であるため、FbpA・FbpBは宿主の創傷治癒過程を遅延させ、本菌の感染拡大に貢献している可能性がある。
そこでDPTのFbpA・FbpB結合サイトの特定を目指し、Fn線維化に関わる領域であるDP-4との結合能を調べたところ、FbpA・FbpBともにDP-4に強く結合していることが明らかとなった。また、菌体外に表出しているFbpC、FbpD、AcpのFn結合に対する貢献度を調べるため、これらの遺伝子を欠損させた株を作製し、Fnとの結合能について検討したところ、fbpC・fbpD欠損株については野生株とほぼ同程度の結合能を有していること、acp欠損株では野生株と比べ、その結合能力が有意に低下した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
遺伝子欠損株を用いた実験にてFbpCまたはFbpDよりもAcpが宿主Fnと結合する可能性が高いことが明らかとなった。しかし、GAPDHにおいては未だ欠損株の作製できていないため、菌体表層上のGAPDHのFnへの接着の貢献度については不明なままである。
また、FbpAおよびFbpBがDPTの中のDP-4と結合していることは明らかとなった。しかし、DP-4以外のDPTの領域との結合性については検討中である。さらにFbpAおよびFbpBのDPTへの結合サイトの特定については進んでいない。DPT誘発Fn線維化に対するFbpC、FbpD、GAPDH、およびAcpの影響については進んでいない。したがってやや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
GAPDH欠損株の作製が想定していたよりも困難なであり、現状作製できていない。そこで、抗GAPDH抗体(ポリクローナル抗体)を菌体に感作させた株を用いてコラーゲン-Fnに対する作用を野生株と比較させ、GAPDHのFn接着における貢献度について検討する。
FbpAおよびFbpBがDPTのどの領域に結合することで、FbpA・FbpBによるDPT誘発Fn線維化を抑制しているかについて、継続して研究を進めていく。次にFbpAおよびFbpBのどの領域がDPTと結合するかについても検討する。
DPT誘発Fn線維化抑制に対する組換え体FbpC、FbpD、Acp、GAPDHの影響についても調べていく。
また、DPTによる創傷治癒作用について血管内皮細胞、三次元皮膚モデル細胞を用いて検討していく。もし、DPTがこれらの細胞に対し、治癒作用などが認められた場合には、FbpA・FbpBにおける影響を調べていく。
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| Causes of Carryover |
GAPDH遺伝子欠損株が作製できなかったために研究活動が予想以上に難航し、研究活動が遅延した。GAPDH遺伝子欠損株の作製については一旦保留とする。遺伝子組換え体DPTの購入、DPTのオーバーラッピングペプチドの業者への作製依頼、FbpA・FbpBのオーバーラッピングペプチドの業者への作製、血管内皮細胞の購入、ヒト皮膚3次元モデル細胞の購入、その他培養のための試薬、プラスチックなどの消耗品を購入する予定である。
旅費については学会活動もコロナ禍であったため、Web開催の学会も多く存在し、旅費はかからなかった。2023年度は国際会議13th International Conference on the Molecular Biology and Pathogenesis of the Clostridiaがカナダ（Banff）にて開催される予定であるため、その費用を主に充てる。
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