新規遺伝子操作系による組換えHBVを用いたHBV polymerase動態解析

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K07087
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 和田 真実 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (00722654)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: HBV / リバースジェネティクス / 転写産物 / pgRNA / 粒子産生

Outline of Annual Research Achievements

現在B型肝炎ウイルス(HBV)研究で用いられているウイルスは、主にHBVゲノムDNAをコードしたプラスミドを肝細胞株に導入することで作製されている。しかしながら、それぞれのウイルス遺伝子が異なるフレームで重なってコードされているため、ウイルスの遺伝子操作が制限され、組換えウイルスの作製は大変困難である。ゆえに、汎用的な新規HBV遺伝子操作系の確立は、HBV研究を大きく進展させる可能性が高い。本研究において、in vitro transcriptionによって作製されたpgRNAを細胞導入した結果、HBV逆転写酵素は機能するものの、主に、ゲノム複製の中間体であるsingle stranded DNAがカプシドに内包されることが分かった。また、計画にあったＴ7ポリメレースを用いたシステムでは、直接pgRNAを細胞内に導入する方法と同様、非常に細胞上清中への粒子産生の効率が悪いことが分かった。今後は、細胞内への効率的なpgRNA導入方法を検討していくことに着目し、アデノウイルスベクターを用いたpgRNA発現を試みる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究において、組換えHBV粒子産生の根幹となるpgRNAから粒子産生を行う方法の確立が大変困難であった。ゲノム複製過程でのsingle stranded DNA形成が効率的に行われていないことから、細胞内pgRNAの発現量及び安定性が影響していることが考えられる。また、トランスフェクション遺伝子導入が困難であるため、肝細胞株を用いた解析を見送っていたことも理由と考えられる。

Strategy for Future Research Activity

本研究において、組換えHBV粒子産生の根幹となるpgRNAから効率的に粒子産生を行うため、肝細胞株を用いてpgRNAの導入効率及び細胞内発現量を増加させる方法を確立する。この問題を解決するため、肝細胞内においてHBV粒子産生が高効率で行われることが報告されているアデノウイルスベクターを用いたpgRNA導入を試みる。HBV pgRNA発現アデノウイルスを、HBV感染許容肝細胞株HepG2及びHuh7細胞に感染させて、細胞内において高いレベルでpgRNA発現を得ることによって、効率的な粒子産生が期待できる。

Causes of Carryover

今年度予算としては、予定通り消耗品購入及び参考資料となる書籍の購入ができた。繰り越し分は、次年度の消耗品購入及びアデノウイルスベクター開発の費用に充てたい。