2023 Fiscal Year Research-status Report
Elucidating of molecular mechanism by which endocytosis regulates NLRP3 inflammasome formation and its phycological significance
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22K07140
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| Research Institution | Nippon Medical School |
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Principal Investigator |
森田 林平 日本医科大学, 大学院医学研究科, 大学院教授 (00362541)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐々木 文之 日本医科大学, 医学部, 助教 (10706469)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | クラスリン / エンドサイトーシス / インフラマソーム / NLRP3 / マクロファージ / 炎症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マクロファージ特異的クラスリン重鎖(CHC)ヘテロ欠損マウス(Cltc+/fl;LysM-cre)を作製し、LPS敗血症モデル実験を行った。Cltc+/flマウスに比べ Cltc+/fl; LysM-creマウスでは、血清IL-1βの濃度が低下し、生存率が有意に上昇することを見出した。一方、腹腔常在性マクロファージを用いたin vitro実験では、CHCの減少は、nigericinやimiquimodによるNLRP3 inflammasomeの活性化の低下を引き起こすことを見出した。これは前年度に行ったCltc-knockdown J774-1細胞株の実験結果と一致する。加えて、CHCの減少はNLRP3のE3リガーゼMARCH7との結合を促し、NLRP3のユビキチン化を増加させることを見出した。
NLRP3はearly endosome(EE)とtrans-Golgi network(TGN)で活性化することが報告されている（Zhang et al. Na Immunol. 2023. & Chen et al. Nature. 2018）。私たちはCHCの減少はマクロファージ内のEEとTGNの形成不全をもたらすことを共焦点レーザー顕微鏡で確認した。つまりCHCは、NLRP3が活性化する場であるEEとTGNの形成に必須の分子であることも見出した。
さらに腹腔常在性マクロファージにトランスフェリンを作用させクラスリン依存性エンドサイトーシス(CME)を亢進させることにより、NLRP3とCHCの結合は減少し、NLRP3はMARCH7と結合しユビキチン化を受け、inflammasomeの活性化が低下することを見出した。
一方、Nlrp3欠損不死化マクロファージでは、CHCとCLC（クラスリン軽鎖）の結合とトランスフェリンの取り込みが亢進していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究により、クラスリン依存性エンドサイトーシスとNLRP3 inflammasomeの活性化はCHCによりバランス制御を受けていることが明らかとなった。つまりCHCはearly endosomeとtrans-Golgi networkの形成を安定化させ、さらにNLRP3と結合してinflammasomeの活性化を促す。一方でエンドサイトーシスにより細胞外物質を取り込む際、CHCはNLRP3を離れCLCと結合し、クラスリン依存性エンドサイトーシスを促す。その際NLRP3 inflammasomeの活性化は抑制される。
現在のところ、NLRP3 inflammasomeの活性化を促す物質（βアミロイド、シリカ、コレステロール結晶など）はファゴサイトーシスにより取り込まれ、lysosomal ruptureあるいは活性酸素種の産生を引き起こすことによりNLRP3 inflammasomeの活性化を誘導すると考えられている（Sharma et al. J Cell Biol. 2016）。しかし、エンドサイトーシスとNLRP3 inflammasomeの活性化の関係は不明であった。本研究では、CHCがこれら2つの細胞活動をつなげるキー分子であることを示した。
これらの研究成果は、「CHCを介してエンドサイトーシスとNLRP3 inflammasomeは相互制御する」という新しい細胞活動の発見につながり、現在、論文を作成中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
① 本研究では、NLRP3のWalker A motifのアラニン置換変異体の発現マクロファージを用いた免疫沈降実験により、CHCはNLRP3のWalker A motifに結合する可能性を見出している。Walker A motifはNLRファミリー分子で保存されていることから（Sandall et al. Molecules. 2020.）、本研究で認めた現象は、NLRP6を発現する腸管上皮細胞やNLRP10を発現する皮膚表皮細胞でも生じていることが予想される（http://biogps.org）。
そこで、本研究の論文を投稿した後に、マウス腸管上皮細胞や皮膚ケラチノサイトを用いて、CHCとNLRP6やNLRP10の結合を免疫沈降法やproximity ligation assayにより調べる。また、Cltc+/fl;Villin-creやCltc+/fl;K14-creの作製を開始する。
② 本研究の中で、マクロファージのCLCの減少はcaspase11の活性化を引き起こすことを見出している。これはCHCと異なりCLCはcaspase11によるnon-canonical inflammasomeの活性化を（直接）抑制している可能性を示唆している。 そこで今後は、マクロファージにおけるCLCとcaspase11の結合を解析し、CLCの新たな機能の解明につなげる。
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