2023 Fiscal Year Research-status Report
新規がん治療法の開発をめざしたp53との合成致死に関与する遺伝子群の探索
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22K07173
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
時野 隆至 札幌医科大学, 医学部, 教授 (40202197)
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2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | p53 / がん抑制遺伝子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年，Long non-coding RNA（lncRNA）ががんに重要な役割を果たすことが多くの研究により明らかにされている．そこで，大腸がんに関与するlncRNAを探索するために，TCGAデータセットにおいて発現解析および生存率解析によるlncRNAのスクリーニングを行った．その結果，大腸がんではlncACp53（仮称）の発現が正常組織と比較して有意に増加しており，その高発現は予後不良と相関していることに明らかにした．
NCBIのデータベースから，lncACp53と隣接するコード遺伝子Kelch Domain Containing 4（KLHDC4）の間に連続した転写産物を発見し，KLHDC4 transcript variant X7（KLHDC4-X7）と命名した．KLHDC4-X7の過剰発現ベクターは，KLHDC4-X7配列がKLHDC4 ORFを含んでいるにもかかわらず，KLHDC4 mRNA発現を増加させたが，KLHDC4タンパク質発現は増加しなかった．si-KLHDC4でKLHDC4-X7をノックダウンし，KLHDC4発現プラスミドでKLHDC4タンパク質の発現を回復させると，アポトーシス活性が上昇した．lncACp53およびlncACp53と同一の塩基配列を含むKLHDC4-X7は，ノンコーディングRNAとして働き，KLHDC4タンパク質とは独立して大腸がん細胞の細胞増殖を促進し，アポトーシスを抑制することが示唆された．KLHDC4-X7は1020残基（340アミノ酸相当）のORF(open reading frame)を有する転写物RNAであるが，核に存在し，長鎖非コードRNA (long non-coding RNA) のように振る舞うことを明らかにした．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
KLHDC4-X7特異的プライマーを用いたRT-PCRおよびサンガーシークエンシングにより，KLHDC4-X7が大腸癌細胞株でも発現していることを確認したKLHDC4の高発現は，上咽頭癌の予後不良因子であることが報告されている．そこで，si-lncACp53がKLHDC4タンパク質の発現に影響を及ぼすかどうかをウェスタンブロッティングで確認した．si-lncACp53またはsi-KLHDC4のトランスフェクションは，KLHDC4-X7 RNAの発現を有意に減少させたが，KLHDC4タンパク質の発現には全く影響を与えなかった．さらに，KLHDC4-X7の過剰発現ベクターは，KLHDC4-X7配列がKLHDC4 ORFを含んでいるにもかかわらず，KLHDC4 mRNA発現を増加させたが，KLHDC4タンパク質発現は増加しなかった．si-KLHDC4でKLHDC4-X7をノックダウンし，KLHDC4発現プラスミドでKLHDC4タンパク質の発現を回復させると，アポトーシス活性が上昇した．さらに，lncACp53を過剰発現させると，コントロールと比較してコロニー形成が有意に増加した．これらの結果から，lncACp53およびlncACp53と同一の塩基配列を含むKLHDC4-X7は，ノンコーディングRNAとして働き，KLHDC4タンパク質とは独立して大腸がん細胞の細胞増殖を促進し，アポトーシスを抑制することが示唆された．lncACp53とKLHDC4-X7の細胞内局在を調べるため，核内画分と細胞質画分におけるこれらの量をqPCRで定量した．その結果，両者とも核内画分に豊富に局在しており，lncRNAの一般的な局在と一致していた．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究の推進方策として，（１）lncACp53欠乏がp53を活性化する機序を分子レベルでの解明を目指す．具体的には，翻訳レベルあるいは翻訳後修飾（リン酸化，アセチル化など）によるp53タンパク質の安定化について，各種のp53変異体を作成し，質量分析などで解析する．（２）lncACp53欠乏および高発現後におけるp53の標的選択性の特徴を詳細に解析する．（３）がんの予後予測および分子標的治療薬の開発への発展を目的として，このlncACp53のように がん細胞で高発現し，かつ高発現群で予後不良と正の相関を示す長鎖非コードRNA遺伝子を同定する．
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| Causes of Carryover |
p53研究に細胞周期・アポトーシス解析に必須の蛍光顕微鏡の既存コントローラが故障し，修理不可能であることがわかった．そのため 急遽 蛍光顕微鏡コントローラーを購入する費用として前倒支払い請求を行った．しかし，研究補助員や大学院生が新型コロナ感染により出勤・登校制限になった期間があったため，一部研究計画に遅れが生じ当該助成金(B-A)が生じた．新型コロナ感染も落ち着き，この遅れは次年度に十分取り戻せると考えている．
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Research Products
(6 results)
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[Journal Article] TM4SF1-AS1 inhibits apoptosis by promoting stress granule formation in cancer cells2023
Author(s)
Kitajima H, Maruyama R, Niinuma T, Yamamoto E, Takasawa A, Takasawa K, Ishiguro K, Tsuyada A, Suzuki R, Sudo G, Kubo T, Mitsuhashi K, Idogawa M, Tange S, Toyota M, Yoshido A, Kumegawa K, Kai M, Yanagihara K, Tokino Takashi, Osanai M, Nakase H, Suzuki H
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Journal Title
Cell Death & Disease
Volume: 14
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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