2022 Fiscal Year Research-status Report
膜タンパク質を標的とした先端的がん特異的抗体の開発とその作用機序解明
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22K07224
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
加藤 幸成 東北大学, 医学系研究科, 教授 (00571811)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | がん特異的抗体 / モノクローナル抗体 / CasMab |
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| Outline of Annual Research Achievements |
モノクローナル抗体は実験的ツールや診断薬としてだけでなく、様々ながん治療に応用されている。一方、がん細胞に特異的な抗体を樹立しなければ、常に正常組織への毒性が懸念される。しかし、がん細胞だけに高発現している分子は限られているため、新規の標的分子を発見するのは困難である。本課題においては、申請者が開発したがん特異的抗体作製法（CasMab法）や糖鎖改変技術（GpMab法）を駆使し、種々の糖タンパク質に対するがん特異的抗体を作製し、その有用性の証明および最適化を目指す。また、樹立したがん特異的抗体ががん細胞に特異性を示すメカニズムの解明を行う。これにより、これまで非常に困難だったがん特異的抗体が効率的に樹立でき、副作用のない抗体医薬や免疫療法の開発が可能となる。
マウスに標的タンパク質発現細胞株あるいは分泌型の標的タンパク質を免疫することにより、標的HXに対する抗体のライブラリーを作製した。抗体のスクリーニングは、精製タンパク質や標的タンパク質発現細胞を用いて行った。細胞株を免疫する場合は、親株と発現株に対する反応性の違いを、フローサイトメトリーで検出した。その結果、フローサイトメトリーで強制発現株（CHO-K1やLN229への強制発現株）および内在性発現株（乳がん細胞株など）に対して高感度に反応する抗体が複数得られた。来年度は、これらの抗体の性状解析を実施する。具体的には、申請者が開発した独自の糖鎖不全株を用いた、糖鎖認識抗体の有無の確認、免疫組織染色によるがん細胞への特異性の有無の確認、標的タンパク質のどの部位を認識しているかの確認（エピトープ探索）、抗体のアフィニティー解析、がん特異性の確認などである。さらに、CasMab法の最適化を行い、HXに対する新規抗体作製を継続する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
モノクローナル抗体は実験的ツールや診断薬としてだけでなく、様々ながん治療に応用されている。一方、がん細胞に特異的な抗体を樹立しなければ、常に正常組織への毒性が懸念される。しかし、がん細胞だけに高発現している分子は限られているため、新規の標的分子を発見するのは困難である。本課題においては、申請者が開発したがん特異的抗体作製法（CasMab法）や糖鎖改変技術（GpMab法）を駆使し、種々の糖タンパク質に対するがん特異的抗体を作製し、その有用性の証明および最適化を目指す。また、樹立したがん特異的抗体ががん細胞に特異性を示すメカニズムの解明を行う。これにより、これまで非常に困難だったがん特異的抗体が効率的に樹立でき、副作用のない抗体医薬や免疫療法の開発が可能となる。
マウスに標的タンパク質発現細胞株あるいは分泌型の標的タンパク質を免疫することにより、標的HXに対する抗体のライブラリーを作製した。抗体のスクリーニングは、精製タンパク質や標的タンパク質発現細胞を用いて行った。細胞株を免疫する場合は、親株と発現株に対する反応性の違いを、フローサイトメトリーで検出した。その結果、フローサイトメトリーで強制発現株（CHO-K1やLN229への強制発現株）および内在性発現株（乳がん細胞株など）に対して高感度に反応する抗体が複数得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は、今年度作製した抗HX抗体の性状解析を実施する。まず、抗体の特異性を確認するため、HXが発現しているがん細胞株を用いて、CRISPR-Cas9技術によりHXノックアウト細胞を作製する。樹立した抗体がHXノックアウト細胞に反応しなければ、HXに特異的な抗体であると判断する。また、申請者が開発した独自の糖鎖不全株を用い、糖鎖認識抗体の有無の確認を行う。具体的には、シアル酸、ガラクトース、N型糖鎖などを付加する糖転移酵素のノックアウト細胞を複数樹立してきたが、これらの細胞にHXを導入し、強制発現株を樹立する。これらの糖鎖不全株に対し、樹立した抗HX抗体の反応性を確認する。糖鎖不全株に対する反応が減弱あるは消失すれば、抗体のエピトープに糖鎖が入っている可能性が示唆される。また、各種がん組織切片に対する免疫組織染色を実施し、がん細胞への特異的反応を確認する。その他、ELISAやフローサイトメトリーによるエピトープ解析、BIAcoreを用いたアフィニティー解析を実施する。
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