癌性腹水中リンパ球による腹膜播種性転移に対するネオ抗原特異的-免疫細胞療法の開発

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K07229
• Research Institution: Shiga University of Medical Science
• Principal Investigator: 小島 正継 滋賀医科大学, 医学部, 助教 (10452236)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 村田 聡 滋賀医科大学, 医学部, 講師 (90239525) ; 住本 秀敏 滋賀医科大学, 医学部, 特任講師 (00306838) ; 谷 眞至 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (60236677)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 癌免疫細胞療法 / ネオ抗原 / 腹膜播種 / 癌性腹水 / 免疫チェックポイント阻害薬 / LAP吸着カラム

Outline of Annual Research Achievements

腫瘍新規抗原(Neo-Ag)に特異的なCTLを，免疫寛容状態の患者癌性腹水中の免疫細胞(TAL)から誘導するためには、効率的neo-Ag同定が困難で、移入免疫細胞が生体内で抗腫瘍活性を失う事を克服する必要がある。そこで、申請者らが開発した腫瘍neo-Agの高効率な同定技術とOX40刺激下培養によるメモリーCTL誘導技術を基に、neo-Agペプチド刺激とOX40補助刺激のもと、TGF-β陽性細胞除去カラムにより免疫抑制性細胞を除去した患者由来TALを培養する事で、担癌生体内でも抗腫瘍機能維持可能な腫瘍neo-Ag特異的メモリーCTLを樹立し、患者腫瘍移植PDXマウス前臨床試験モデルで治療効果を検証するための研究を開始した。
癌性腹水のある胃癌、大腸癌患者から、癌性腹水と正常組織より抽出したDNAから、次世代シークエンサーを用いて癌細胞での体細胞突然変異を同定を試みている。アミノ酸変異を伴う変異に絞り、患者HLA-class Iに親和性の高い変異抗原ペプチドをNeo-Ag候補とし、さらにTALに免疫原性のあるNeo-Agを同定。　同定したNeo-Agペプチドを合成を進めているところである。
同時に、患者の癌性腹水中の癌細胞が免疫不全マウスの腹腔内で生着した腹膜播種性転移-PDXマウスモデルを、胃癌、大腸癌患者ごとに作製している。乳癌、胆道癌患者由来のPDXモデルの作成も試みているところである。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

予定した実験が概ね実施できている。

Strategy for Future Research Activity

Neo-Agの同定；胃癌大腸癌の他、癌性腹水（胸水）のある食道癌、膵癌、胆道癌、乳癌患者に対して、癌性腹水（胸水）と正常組織より抽出したDNAから、次世代シークエンサーを用いて癌細胞での体細胞突然変異を同定。・アミノ酸変異を伴う変異に絞り、患者HLA-class Iに親和性の高い変異抗原ペプチドをNeo-Ag候補とし、さらにTALに免疫原性のあるNeo-Agを同定。　同定したNeo-Agペプチドを合成していく。
２）OX40刺激によるメモリーCTLの誘導；患者癌性腹水由来のTALからTGF-β陽性細胞除去カラムにより、免疫抑制性細胞(TregやMDSC)を除去したT細胞を分離する。・抗原提示細胞として、患者末梢血単核球（PBMC）より分離したCD4+T細胞をPHAにて刺激・増殖し、PHA-blastを作成する。・PHA-bla
stを抗原刺激細胞として、合成Neo-Agペプチドをパルスし、TAL由来T細胞を培養刺激する。・分離したT細胞に対して、Neo-Agペプチド刺激とOX40補助刺激下に培養し、Neo-Ag特異的-メモリーCTLを誘導する。
３）CTLのNeo-Ag 特異性の検証；誘導されたCTLのNeo-Ag 特異性は、Neo-Agペプチド再刺激によるCTL細胞内IFN-γ染色（ICS）により確認する。
４）PDXモデルにより免疫細胞療法の抗腫瘍活性の証明；患者の癌性腹水中の癌細胞が免疫不全マウスの腹腔内で生着した腹膜播種性転移-PDXマウス腹腔内へ、同一患者のTALから誘導したNeo-Ag特異的メモリーCTLを細胞移入し、抗腫瘍効果を観察する。

Causes of Carryover

概ね予定通りの予算執行が実施できたが、17,618円の次年度使用額が生じた。
翌年度分として請求した助成金と合わせて、患者腫瘍由来のPDXマウスモデル作成のための免疫不全マウス購入に使用する予定である。