2023 Fiscal Year Annual Research Report
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22K07298
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
西尾 信博 名古屋大学, 医学系研究科, 特任准教授 (00586430)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高橋 義行 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (40432273)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | GD2 / CAR / piggyBac |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、CARの構成成分のうち、scFv部分の中のVHとVLをつなぐlinker部分の長さとspacer部分の長さに着目して、CARを改変し、その機能解析を実施する。 ベースとなるCARはGD2を標的としたGD2.CARを用い、遺伝子導入には代表者らが開発したpiggyBacトランスポゾン法を用いる。 異なる抗原認識部位の配列情報とCD28、4-1BBなどの異なる共刺激分子をもつGD2.CARに、さらにlinkerとspacerを改変した複数のGD2.CARコンストラクトを作成した。上記のGD2.CARを、申請者が所有するCD19.CARトランスポゾンベクター(pIRII-CAR.CD19.28.ζ)のCAR配列と入れ替え(pIRII-CAR.GD2.28.ζまたはpIRII-CAR.GD2.4- 1BB.ζ)、GD2.CARトランスポゾンベクターを作成した。GD2CAR-T細胞製造のために培養条件を最適化した。末梢血リンパ球に、ヌクレオフェクション装置を用いて、GD2.CARトランスポゾンベクターとpiggyBac遺伝子転位酵素ベクターを導入し、自家feeder細胞とインターロイキン(IL)-7およびIL-15を添加した培地中で共培養したのちに増殖刺激を加え、GD2CAR-T細胞を作成した。フローサイト メトリーを用いてT細胞上のGD2.CAR発現率、CD45RA/CCR7細胞比率等を測定した。さらにCAR-T細胞と神経芽腫細胞株をサイトカイン無添加・10%血清存在下で共培養し、GD2.CAR-T細胞の抗原特異性、細胞傷害活性、細胞表面exhaustionマーカー、CAR-T細胞のpersistencyなどを検討した。その結果をもとに免疫不全マウスを用いたin vivo実験を実施した。
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