乳癌原発巣におけるESR1遺伝子変異の高感度検出

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K07301
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 橋本 陽子 大阪大学, 大学院医学系研究科, 招へい教員 (00894247)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 増永 奈苗 大阪大学, 大学院医学系研究科, 助教 (60961620)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: ESR1 mutation / primary breast cancer

Outline of Annual Research Achievements

乳癌原発巣でのESR1変異を高感度に検出する変異解析手法を確立した。具体的には、変異を有する遺伝子のみを選択的に増幅させるPCR clampingを応用し、ESR1 wild-type DNAをclampする人工核酸(LNA oligo)を設計し、変異の濃縮効果や解析結果への影響を確認した。変異検出のターゲットは、ESR1変異の上位2変異であるY537S (1610A>C)およびD538G(1613A>G)とし、そのそれぞれの変異部位に対して独自のLNA-oligoを設計した。設計したLNA-oligoでのclamp効果を検証した結果、約6,000万コピーもの大量のwild-type DNAをクランプできることが実証された。また、wild-typeとmutant-typeを混ぜてPCRを行い、wild- typeを完全にブロックし、混在する変異オリゴには影響を与えないPCR条件を検討した。このLNA oligoを用いてESR1変異検出の感度検定を行い、0.003%程度の微小変異まで検出できることを確認した。さらに、原発巣に含まれる微小変異をより高確率に捉えるために、DNAではなくmRNA(cDNA)を解析対象とすることとした。予備実験として、乳癌細胞株10種にてDNAとmRNAのESR1発現割合を比較し、ER陽性細胞株ではmRNAの方が約3.42倍(1.02-8.92)発現が多い事も実証された。この手法を用いて、pilot studyを行った。乳癌原発巣から採取した新鮮凍結組織(FF)30例よりmRNA(cDNA)を抽出し、PCR clampingを用いたddPCRでESR1変異(Y537S, D538G)について解析を行った。実際のサンプルでも問題なく解析ができることが判明した。今後、この手法を用いて、約200例のサンプルに関して変異解析を行い、乳癌原発巣中のESR1微小変異について調べる予定としている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでの研究の進捗により、解析手法が概ね確立した。今後は、この手法で実際のサンプル解析を進める事としている。

Strategy for Future Research Activity

今後は、確立した解析手法を用いて、実際のサンプルの解析を進める事としている。

Causes of Carryover

解析手法を確立するための予備実験を進めたため、次年度使用額が生じた。
今後はサンプル解析を進めるため、解析に必要な物品費として費用を使用する予定である。