過去の細胞状態の記録による神経炎症ミクログリアの時空間的解析

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 22K07347
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 永田 健一 名古屋大学, 医学系研究科, 特任講師 (50587798)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉見 一人 東京大学, 医科学研究所, 准教授 (50709813)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 神経炎症 / ミクログリア / シングルセルRNA-seq / ゲノム編集 / Creマウス / 神経損傷 / ケモカイン

Outline of Annual Research Achievements

昨年度、ゲノム編集技術を使って神経炎症の痕跡を組織中に保持するマウス系統を作製した。作製したマウスはCxcl10-CreマウスとCre依存性のレポーターマウスと交配することによって得られたマウスであり、神経炎症を経験した細胞集団が蛍光タンパクで標識されていた。本年度は、当該マウスにおける蛍光標識についてより詳細な評価を行った。まず、炎症を惹起させていない組織中の蛍光標識を評価した。多重免疫染色によって、Cd31陽性の血管内皮細胞、S100b陽性のアストロサイトが蛍光標識されることが分かった。Iba1陽性ミクログリアの一部も蛍光標識されていた。次に舌下神経損傷により炎症を惹起させ、ミクログリアの蛍光標識を対象に、時間経過に伴う変化を評価した。神経損傷後3日目では、Iba1陽性ミクログリアは大幅に増加したが、ほとんどの細胞では蛍光標識されることはなかった。7日後、10日後では、依然として蛍光標識されていない集団も認められたものの、蛍光標識された集団は増加していた。14日後では、蛍光標識された集団の割合はさらに高まり、21日後、28日後においても蛍光標識は維持されていた。さらに、当該マウスのCre発現の特異性を確かめるためにシングルセルRNA-seqを実施した。神経損傷後の舌下神経核を回収し、細胞核を単離した後に、10x Genomicsのプラットフォームでライブラリーを調整し、一定以上の細胞あたりリード数でシークエンスをよんだ。Creの発現は、Cxcl10陽性のミクログリアクラスターに認められた。
また、損傷舌下神経核に浸潤してくる末梢由来の免疫細胞集団を対象とした実験を行った。CCR2ヘテロマウスと比較して、CCR2ノックアウトマウスでは損傷神経核への浸潤細胞数が減少しており、ケモカイン受容体CCR2が浸潤プロセスに重要であることが明らかとなった

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

作製したマウスの特性を免疫染色とシングルセルRNA-seqの両面から評価し、一定の特異性をもって炎症ミクロゴリアが標識されることが明らかとなった。

Strategy for Future Research Activity

神経炎症の痕跡を組織中に保持するマウスを使うことで、ある時点で炎症を経験したミクログリアがその後どうなるのか、炎症過程で生じる変容について理解を目指す。また、脳常在の免疫細胞であるミクログリアと、末梢由来の浸潤免疫細胞がどのような関係にあるのかを評価していく。

Causes of Carryover

本年度実施予定だった一部の実験について前年度にすでに完了していたため、予定していた実験の一部を実施することなく済んだ。生じた次年度使用額を使って、追加の組織学的実験を実施する予定である。