2022 Fiscal Year Research-status Report
生理的機能を有するALS細胞モデルの構築とその病態解析
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22K07356
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| Research Institution | Tokai University |
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Principal Investigator |
大友 麻子 東海大学, 医学部, 講師 (50535226)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
秦野 伸二 東海大学, 医学部, 教授 (60281375)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | 筋萎縮性側索硬化症 / ALS / 上位運動ニューロン / 下位運動ニューロン / 骨格筋 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
筋萎縮性側索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）は、大脳皮質運動野の上位運動ニューロン（UMNs）と脳神経及び脊髄前角の下位運動ニューロン（LMNs）の選択的変性と脱落を特徴とする進行性の神経変性疾患である。本研究では、ALS疾患特異的障害部位である、UMNsとLMNs、及びLMNsと骨格筋（MSCs）の機能的な結合、さらにはUMNsとLMNs及び MSCs の結合を有する新たなALS細胞モデルを構築することを目的とする。本年度は、細胞材料の作製を進めた。ALS疾患モデル細胞として、上位運動ニューロン変性が優位なALS2型（ALS2変異）と、下位運動ニューロンの変性が優位であるALS6型（FUS変異）に着目した。健常者由来の人工多能性幹細胞（iPSCs）を用いて、ALS2ノックアウトiPS cell lineを作製した。同時に、同一バックグラウンドを持つiPSCsにFUS変異を持つiPSCsを入手した。それらiPSCsを用いて、LMNsの運命決定遺伝子をテトラサイクリン依存的に発現する遺伝子カセットを導入し、安定的にそれらを発現する細胞をプールとして確保した。健常者、ALS2型、FUS型のiPSCsを下位運動ニューロンへと分化誘導後、細胞生存率について解析を行った結果、分化誘導後2-3週間の時点においてもFUS細胞モデルにおいて顕著に細胞生存率が低下していた。一方で、ALS2細胞モデルでは、細胞生存率は維持されていた。現在、UMNsを含む興奮性神経細胞及び骨格筋についてもそれぞれの分化に関わる転写因子の導入を行い、細胞の特異性や性質を精査している。これらが終了後、共培養を開始し、細胞同士の機能的結合を有するALS細胞モデルの構築を行う計画である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、実験計画に従って、細胞材料の作製を進めた。実験計画当初は、オプトジェネティクスを用いて、光刺激によって神経細胞を刺激し、細胞同士の結合及びシナプス機能評価を行う計画であったが、近年、Caged-Glutamateなどのケージド化合物の使用が可能となったため、実験計画を精査し、ChR2を発現するクローン株の取得は行なわなかった。また、実験に用いる細胞種の品質を維持し、細胞数を確保するため、iPSCsからそれぞれの細胞種への分化誘導方法を工夫した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では、上位運動ニューロンと下位運動ニューロン及び下位運動ニューロンと骨格筋共培養によって生理学的結合を有するALS共培養モデルを作製して神経機能に着目した表現型を解析し、ALS疾患に特徴的な表現型が再現されるのかを検証する。疾患表現型の再現を確認後、健常者との比較を遺伝子発現プロファイルやタンパク質動態に着目して行い、UMNs及びLMNsの疾患感受性を生み出すメカニズムを解明する。2022年度までに、健常者、UMNs優位型ALS（ALS2）及びLMNs優位型ALS（ALS6）iPSCsよりを分化誘導可能なiPSC細胞株を取得した。本年度は、UMNsを含む興奮性神経細胞及び骨格筋についてもそれぞれの分化に関わる転写因子の導入を行い、細胞の特異性や性質を精査している。これらが終了後、共培養実験を開始し、細胞同士の機能的結合を有するALS細胞モデルの構築を行う計画である。2023年度は、共培養開始後、2-3週間後に免疫染色やqPCRによって、シナプスマーカーの発現やシナプス形態の定量化を行う。シナプス伝達は、Ca2+ imageing を行いて評価する。同時に、MEA（Microelectrode arrays, 微小電極アレイ）を用いた電気生理学的解析による生理的結合評価評価を行う。それらの解析を通じ、ALS特異的な疾患表現型の再現を確認後、健常者由来のサンプルと、UMNs優位型ALS（ALS2）及びLMNs優位型ALS（ALS6）のサンプルのそれぞれの細胞を用いて網羅的遺伝子発現解析をmRNA-seq解析を行うことによって、細胞表現型の生じる背景にあるメカニズムを明らかにする。
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| Causes of Carryover |
本年度は、コロナウイルス感染症の拡大の影響を考えて、国際学会への参加を断念した。そのため、旅費として計上した予算を使用せずに繰り越した。また、予定していたオプトジェネティクス実験用の発現ベクターの利用について中止したため少し消耗品費の使用を少なくすることが出来た。研究計画に従って、本年度予定していた研究を行うため、本年度の請求額については実験計画に従って使用し、本年度繰越す予定の研究費（223,075円）については、統計解析ソフトウエアの購入に使用し、研究データの解析に用いる計画である。
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